Hvorfor brukes PCR i prosessen med DNA-sekvensering

DNA-sekvensering er en teknikk som brukes til å bestemme nukleotidsekvensen av et bestemt DNA-fragment. Sanger-sekvensering og neste generasjons sekvensering er to typer sekvenseringsmetoder. Fluorescerende markører brukes til å identifisere hvert nukleotid i sekvensen. PCR brukes til inkorporering av fluorescerende markører i DNA-fragmentet. PCR (polymerasekjedereaksjon) er en teknikk som brukes i laboratoriet for å produsere millioner av kopier av et bestemt DNA-fragment. Analysen av PCR-fragmentene i gelen tillater bestemmelse av nukleotidsekvensen av DNA-fragmentet.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er sekvensering
     - Definisjon, Typer av sekvensering - Next Generation Sequencing, Sanger Sequencing
2. Hvorfor brukes PCR i prosessen med DNA-sekvensering
    - Inkorporering av fluorescerende fargestoffer under PCR

Nøkkelbetingelser: ddNTPs, dNTPs, DNA-sekvensering, fluorescerende fargestoffer, neste generasjons sekvensering, PCR, Sanger Sequencing

Hva er sekvensering

Sekvensering er en laboratorieteknikk som brukes til å bestemme nukleotidsekvensen til et DNA-molekyl. Sanger-sekvensering og neste generasjons sekvensering er de to viktigste metodene for DNA-sekvensering. Begge DNA-sekvenseringsmetodene er involvert i inkorporering av fluorescerende produsenter til DNA-strengen ved PCR for bestemmelse av nukleotidsekvensen av en bestemt DNA-streng.

Sanger-sekvensering

Den første sekvenseringsmetoden, som er kjent som Sanger-sekvensering, blir først utviklet av Fredric Sanger i 1975. Følgelig er den kjent som Sanger-sekvensering. Sanger-sekvensering er involvert i selektiv inkorporering av kjede-terminerende dideoxynukleotider (ddNTPS) ved DNA-polymerase under in vitro DNA syntese. Derfor er det også kjent som kjedeavslutningsmetode. Vanlige deoxynukleotider (dNTPer) brukes til forlengelse av DNA-streng. ddNTPs blir også tilsatt til reaksjonsblandingen for terminering av kjedeveksten. De fire typer ddNTPs blir tilsatt til fire separate PCR-blandinger. Derfor utføres fire separate PCR-reaksjoner ved å tilsette ddATP, ddGTP, ddCTP og ddTTP. For hver reaksjonsblanding termineres en enkelt type tilsatt ddNTP (dersom ddATP blir tilsatt), veksten av forskjellige amplikoner ved hvert (A) nukleotid i DNA-fragmentet. Deretter separeres de fire reaksjonene ved gelelektroforese. Den emitterende fluorescens detekteres av et fluorometer. Sanger-sekvensering er mye brukt for bestemmelse av sekvensen av fragmentene som brukes i DNA-kloning og fragmentene amplifisert ved PCR. Den generelle prosedyren for Sanger-sekvensering er vist i Figur 1.

Figur 1: Generell prosess for sanger-sekvensering

Neste generasjons sekvensering

Neste generasjons sekvensering er det kollektive navnet på de nyeste DNA-sekvenseringsteknologiene. Flere sekvenseringsreaksjoner utføres i mikroskala på en brikke på en gang i neste generasjons sekvensering. Begge sekvenseringsmetodene bruker merkede nukleotider med fluorescens som inkorporeres i amplikonet under PCR, slik at bestemmelsen av nukleotidsekvensen. Kjedeterminerende tilsetning av fluorescerende markører er også involvert i neste generasjons sekvensering. Imidlertid er hovedforskjellen mellom Sanger-sekvensering og neste generasjons sekvensering bruken av kapillærelektroforese for separasjon av annerledes merkede amplikoner i neste generasjons sekvensering. Kapillærelektroforese er en analytisk separasjonsmetode hvor molekylene separeres basert på deres elektroforetiske mobilitet.

Hvorfor brukes PCR i prosessen med DNA-sekvensering

Under sekvensering bør fluorescerende markører inkorporeres i DNA-strengen for bestemmelse av nukleotidsekvensen. Denne innlemmelsen finner sted under PCR. Generelt er de fire typene dNTPer inkorporert i den nylig syntetiserende DNA-strengen under PCR. Dette fenomenet brukes i DNA-sekvensering for å inkorporere fluorescerende merkede dideoxynukleotider (ddNTPer) i amplikonet mens DNA-sekvensen bestemmes.

Vanligvis tilsettes en blanding av vanlige fire baser (dNTPs, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) til PCR-reaksjonsblandingen under DNA-sekvensering.

I tillegg tilsettes en av de fire dideoxynukleotidene (ddNTPs, ddATP, ddGTP, ddCTP og ddTTP) som komponenter av PCR-reaksjonen i en lav konsentrasjon. Til slutt må fire PCR-reaksjoner utføres for å bestemme den komplette sekvensen. 

Figur 1: En bestemt DNA-sekvens

De ddNTPs mangler 3'-OH-gruppe til hvilket det innkommende nukleotid tilsettes ved DNA-polymerase. Derfor slutter inkorporeringen av ddNTP kjedeveksten. Således, i hver av de fire PCR-reaksjonene, skjer kjedetermineringen ved en bestemt base. Disse ddNTP er også innarbeidet med forskjellige fluorescerende fargestoffer (De ddATP er merket med grønt fargestoff; de ddGTP er merket med gult fargestoff; de ddCTP er merket med blå, og ddTTP er merket med rødt fargestoff). Inkorporeringen av fluorescerende fargestoffer og kjedeavslutningen finner sted under PCR. Amplikonene kjøres på en gel, og gelen blir skannet for fluorescens med et fluorometer i den automatiserte sekvenser for bestemmelse av nukleotidsekvensen.

Konklusjon

DNA-sekvensering er en laboratorieteknikk som brukes til å bestemme nukleotidsekvensen av et bestemt DNA-fragment. Sanger-sekvensering og neste generasjons sekvensering innlemme forskjellige fluorescerende fargestoffer inn i DNA-fragmentet for bestemmelse av nukleotidsekvensen under en PCR.

Henvisning:

1. Adams, Jill U. "DNA Sequencing Technologies." Nature News, Nature Publishing Group, tilgjengelig her.
2. "Sequencing DNA - Automated Sequencing With Fluorescent Dyes." JRank Artikler, tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "Sanger-sekvensering - generell" Автор: Bruker: Fibonachi - власна робота (CC BY-SA 1.0) via Commons Wikimedia [modifisert] 2. "DNA-sekvens" Av Sjef - Eget arbeid (Public Domain) via Commons Wikimedia