Hvordan designe Primers for Site Directed Mutagenesis

Site-directed mutagenese (SDM) er en in vitro metode for å skape en mutasjon i en kjent sekvens. Det utføres ofte ved PCR-baserte metoder. Vanligvis blir ett eller to baser endret i stedet-rettet mutagenese. Primerne kan utformes med de ønskede mutasjoner for å introdusere små endringer i nukleotidsekvensen. Primerforlengelse og invers PCR kan brukes til å introdusere storskala mutasjoner. Denne tilnærmingen kan endre aminosyresammensetningen av et bestemt protein. Site-directed mutagenese brukes til å studere endringene av proteinaktiviteten. Det brukes også til å lage fusjonsproteiner også.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er Site-Directed Mutagenesis (SDM)
      - Definisjon, rolle, metode
2. Hvordan utforme Primers for Site-Directed Mutagenesis
     - Substitusjoner, Slettinger, Innlegg

Nøkkelbegreper: Slettinger, Innsetting, Mutasjoner, Site-Directed Mutagenese, Substitutions, Tradisjonell PCR

Hva er Site-Directed Mutagenesis

Site-directed mutagenese er en molekylærbiologi teknikk som brukes til å introdusere spesifikke endringer i en nukleotidsekvens av et gen. Det brukes til å endre aminosyresekvensen til et protein, introdusere eller fjerne restriksjonssteder, ødelegge transkripsjonsbindingssteder og skape fusjonsproteiner.

Prosess

Under stedsstyrt mutagenese blir mutasjonene introdusert til plasmidene under anvendelse av primere, bestående av den ønskede mutasjon. Hele malen blir forsterket av PCR, og innlemmer mutasjonen i malen. Deretter fjernes modermalen fra prøven ved bruk av et enzym, metyleringsavhengig endonuklease. PCR-produktet eller det nickede plasmidmolekylet med den ønskede mutasjon transformeres til bakterier. Plasmidene kan isoleres fra bakteriene med ønskede modifikasjoner. Prosessen med stedrettet mutagenese er vist i Figur 1.

Figur 1: Site-Directed Mutagenesis

Tre hovedtyper av metoder brukes til å introdusere ønskede mutasjoner i stedet-rettet mutagenese. De er tradisjonelle PCR, primer forlengelse og inverse PCR. Primerforlengelse og invers PCR kan brukes til å introdusere storskala nukleotidendringer.

Tradisjonell PCR

Tradisjonell PCR kan brukes til å introdusere en eller to nukleotidendringer i målsekvensen med modifiserte primere. Endringene kan være nukleotidsubstitusjoner, deletjoner eller tillegg. Mutasjonen inkorporeres i amplikonet under PCR. Derfor erstattes den opprinnelige sekvensen med den muterte sekvensen i primeren.

Primerforlengelse

I primerforlengelsen inkorporeres den ønskede mutasjonen under en nestet PCR. Her flettes målsekvensen av to primere. Den ønskede mutasjonen inkorporeres i den indre primeren, og mutasjonen blir introdusert i den andre PCR-runden. Generelt reduseres spesifisiteten til en PCR-reaksjon med det økte antall mismatchede nukleotider i primrene. Imidlertid kan lange interne primere med storskala mutasjoner brukes i primerforlengelse som nestet PCR kan øke spesifisiteten til PCR-reaksjonen.

Inverse PCR

Inverse PCR er en metode for å amplifisere ukjente DNA-fragmenter ved å designe primere til en kjent DNA-sekvens. Det kan brukes til å erstatte, slette eller sette nukleotider i stor skala.

Anvendelsene av sted-rettet mutagenese er beskrevet nedenfor.

1. Å studere struktur, funksjon og katalytiske egenskaper av proteiner
2. For å forbedre egenskapene til proteiner (protein engineering)
3. Å introdusere eller fjerne restriktionsendonukleaser.

Hvordan utforme Primers for Site-Directed Mutagenesis

Site-directed mutagenese er en prosess for å introdusere den ønskede mutasjonen ved hjelp av en primer. Mutasjonen kan være en substitusjon, innsetting eller sletting. Etter hvert som spesifisiteten til PCR reduseres med de stigende mismatchede nukleotidene i primeren, kan tradisjonell PCR kun introdusere ett eller to baseparendringer til målsekvensen. Andre metoder som primer forlengelse og inverse PCR kan brukes til å introdusere storskala mutasjoner. Primerdesignen i stedet-rettet mutagenese er vist i figur 2.

Figur 2: Primers for Site-Directed Mutagenesis

Innbytte

For substitusjoner bør en av de to primrene inneholde den ønskede mutasjonen i midten av primeren. Her er nettstedet som inneholder mutasjonen ikke anneal for målsekvensen siden det danner en forvrengning.

sletting

For sletting, kan sekvensen som skal slettes fra målet, bli neglisjert under primerdesignen. Da denne sekvensen ligger bortsett fra den flankerte regionen av primere, ville den ikke bli forsterket under PCR.

Innsetting

For innsetting er sekvensen som skal tilsettes, entanglet til 5'-enden av en av primrene under primerdesign. Derfor kan den innsatte sekvensen forbli festet til amplikonet også.

Konklusjon

Site-directed mutagenese er en teknikk som brukes til å introdusere mutasjoner i en DNA-sekvens. Disse mutasjonene kan være substitusjoner, innsetting eller deletjoner. Småskala mutasjoner kan innføres i den tradisjonelle PCR. Storskala mutasjoner kan innføres i primer forlengelse eller invers PCR. Innføringen av mutasjonen gjøres ved inkorporering av den ønskede mutasjon til primeren. 

Henvisning:

1. "Metoder for sted-rettet mutagenese." INTEGRERTE DNA-TEKNOLOGIER, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "Site Directed Mutagenesis" Av Knbusby - Eget arbeid (Public Domain) via Commons Wikimedia