Hvordan lage Primers for QPCR

Kvantitativ eller sanntids-PCR brukes som en rutinemessig analyse for å overvåke de relative endringene i genuttrykk under forskjellige eksperimentelle forhold. Utforming av primere samt prober under QPCR er en av de mest avgjørende faktorene som påvirker kvaliteten og suksessen til analysen. Flere retningslinjer gjelder for utformingen av primere for QPCR: GC innhold av primere skal være 35-65%; smeltetemperaturen til primrene bør være innenfor 60-68 ° C; man bør også unngå sekundære strukturer, gjentakelser av Gs eller Cs som er lengre enn 3 baser, og dannelsen av primerdimerer.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er QPCR
      - Definisjon, prosess, bruk
2. Hvordan lage Primers for QPCR
     - Retningslinjer for Primer Design for QPCR

Nøkkelbetingelser: Fluorescerende fargestoffer, GC-innhold, Smelte-temperatur, Primers, Kvantitativ PCR (QPCR)

Hva er QPCR

QPCR er en type PCR som gjør det mulig å kvantifisere produktet i sanntid. Fluorescerende fargestoffer kan brukes ved kvantifisering av PCR-produkter ved å merke dem i hvert trinn. To metoder for fluorescensmerking kan brukes i QPCR-analyser. De er bruk av fluorescerende fargestoffer og de fluorescens-merkede prober. Fluorescerende fargestoffer binder til PCR-produktet mens probes annealerer med PCR-produktet for å danne et stabilt triplex-DNA. Det vanlige fluorescerende fargestoffet i QPCCR er SYBR Green mens probene kan være Taqman. Bruken av prober i påvisning av PCR-produkter under QPCR gir mer nøyaktige resultater og øker sensitiviteten til analysen.

Figur 1: Mekanisme for QPCR

Hvordan lage Primers for QPCR

Utformingen av primere for QPCR er avgjørende for å øke påliteligheten, nøyaktigheten og sensitiviteten til analysen. Retningslinjer for utformingen av QPCR primere er beskrevet nedenfor.

1. PCR-produkt / Amplicon-størrelse - Størrelsen på PCR-produktet skal være 50-210 basepar i størrelse.
2. Primer lengde - Primerenes lengde skal være 19-23 nukleotider.
3. GC innhold - GC innholdet av primere skal være 35-65%.
4. Smeltemperatur (Tm) - Smelttemperaturen til primere skal være 60-68 ° C. Annealingstemperaturen for analysen er 5 ° C mindre enn Tm av primrene.
5. Exon-ekson-krysset - Ved amplifisering av cDNA ved QPCR, bør primrene spore exon-ekson-krysset for å unngå amplifikasjon av forurensende DNA.
6. Gjentakelser og kjøringer - Dinucleotidrepetater (TCTCTCTCTC) og gjentatte nukleotider (f.eks. TAAAAAAAGC) bør unngås.
7. 3 'Komplementaritet - De komplementære områdene av 3'-enden av fremover- og revers-primere bør unngås for å forhindre dannelsen av primerdimere.
8. 3 'Stabilitet - G- eller C-rester skal inkluderes i 3'-enden av primeren for å øke stabiliteten til annealing.
9. GC klemme - En eller to GC klemmer ved 5'-enden av primeren øker spesifisiteten til annealing.
10. Specificitet - Specificiteten av primrene bør kontrolleres av BLAST
11. SNPs - Primers bør ikke inneholde noen kjente SNP (single nucleotide polymorphism) variasjoner

Flere nettverktøy kan brukes i primerdesignen i QPCR som Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank og OAT.

Figur 2: Formasjon av Primer-Dimers

Primere bør utformes på en slik måte at unngår dannelsen av primerdimerer i QPCR. Det er kritisk når du bruker fluorescerende fargestoffer til påvisning av PCR-produktet siden disse fargene også binder med primerdimere for å gi falske positive resultater.

Konklusjon

QPCR brukes i deteksjon og kvantifisering av PCR-produkter. Utformingen av primere er avgjørende for QPCR for å øke nøyaktigheten av resultatene. Derfor er det viktig å følge retningslinjene nøye ved utforming av primere for QPCR.

Henvisning:

1. "QPCR-analyseutforming og optimalisering." LSR | Bio-Rad, tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

 

1. "Taqman" Av bruker: Braindamaged - Egentlig arbeid av den opprinnelige opplasteren (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Primer dimers formation En" Av Tzachi Bar - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia