Slik beregner du transfeksjonseffektivitet

Transfeksjonseffektivitet kan beregnes ved å telle antall celler transfektert over de totale cellene i en bestemt prøve. Antall celler kan telles med to metoder. Den mest brukte metoden er å bruke lett gripbare journalister. Disse rapportørene kan være grønt fluorescensprotein (GFP), luciferase, beta-galaktosidase, utskilt alkalisk fosfatase (SEAP). Nyeste metode for å beregne transfeksjonseffektivitet er å merke nukleinsyrer, slik at det kan spores intracellulær levering av dem. Noen andre tilnærminger som Western blotting, immunostaining og funksjonelle analyser kan også brukes til å beregne transfeksjonseffektivitet. Siden transfeksjonseffektivitet avhenger av flere eksperimentelle parametere, er bestemmelsen av transfeksjonseffektivitet nøkkelen til å bestemme innflytelsen av forskjellige faktorer på transfeksjonen.

Nøkkelområder dekket

1. Hvilke metoder brukes til å beregne transfeksjonseffektivitet
     - Reporter Systems
2. Slik beregner du transfeksjonseffektivitet
     - Cell Counting

Nøkkelbetingelser: Flowcytometri, GFP, Nucleic Acid Labeling, Reporter System, Transfeksjonseffektivitet

Hvilke metoder brukes til å beregne transfeksjonseffektivitet

Ulike typer metoder brukes til å beregne transfeksjonseffektivitet.

1. Reporter Systems

- Grønt fluorescensprotein (GFP) - GFP er naturlig funnet i maneter. Den brukes til både kvalitativ og kvantitativ analyse av transfekterte celler ved samtidig transfeksjon av GFP-genet med genet av interesse. Kvalitativ analyse kan gjøres under et fluorescensmikroskop. Kvantitativ analyse kan utføres ved hjelp av flytcytometri. I tillegg til GFP kan rødt fluorescensprotein (RFP) og gult fluorescensprotein (YFP) også brukes som journalister. E coli Kolonier som uttrykker fluorescerende proteiner er vist i Figur 1.

Figur 1: Fluorescerende proteiner

• luciferase - Luciferase er naturlig funnet i ildfluer, genererer lys. Luciferase-analyser er svært følsomme og kan brukes til kvantitativ analyse av transfektert DNA.
• Beta-galaktosidase - Beta-galaktosidase finnes i E coli. Den brukes i den kvalitative analysen gjort med X-gal og den kvantitative analysen utført av kolorimetriske, fluorescerende eller kjemiluminescerende metoder.
• Sekretert alkalisk fosfatase (SEAP) - SEAP er en varmestabil reporter, som utskilles fra pattedyrceller når de uttrykkes.

2. Nucleic Acid Labeling - Fluorescens-merkede plasmider kan anvendes i transfeksjonen. Deretter kan de telles under et fluorescensmikroskop.

3. Western blotting, immunostaining og andre funksjonelle analyser

Slik beregner du transfeksjonseffektivitet

Antallet celler som viser reporteren og antall celler som ikke viser reporteren, kan telles under et mikroskop eller ved hjelp av flytcytometri. Prosentandelen av celler som utviser reporteren gir transfeksjonseffektiviteten.

Figur 2: Transfeksjonseffektivitet

Konklusjon

Transfeksjonseffektivitet kan beregnes ved å bestemme antallet celler som viser transfektert DNA over det totale antall celler i prøven. Antall celler kan beregnes under mikroskopet eller ved hjelp av et flytende cytometri ved hjelp av et reportersystem.

Henvisning:

1. "Mål transfeksjonseffektivitet." Mirus Bio LLC, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "E. coli uttrykker fluorescerende proteiner "Av Erin Rod - Eget arbeid, (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia