Hvordan virker Illumina Sequencing Work
Share
Illumina-sekvensering er en neste generasjons sekvenseringsmetode, som også kalles "sekvensering ved syntese"Metode. Illumina-sekvensering er involvert i prosessering av millioner av fragmenter parallelt. De fire grunnleggende trinnene som er involvert i Illumina-sekvenserings-arbeidsflyten, er bibliotekspreparasjon, klyngegenerering, sekvensering og dataanalyse, som er nærmere beskrevet i denne artikkelen.
Nøkkelområder dekket
1. Hva er Illumina Sequencing
- Definisjon, fakta, fordeler
2. Hvordan virker Illumina Sequencing Work
- Prosess av Illumina sekvensering:
- Biblioteksforberedelse
- Cluster Generation
- sekvense~~POS=TRUNC
- Dataanalyse
Nøkkelbetingelser: Cluster Generation, Data Analysis, Illumina Sequencing, Library Preparation, Sequencing by Synthesis
Hva er Illumina Sequencing
Illumina sekvensering eller sekvensering-ved-syntese (SBS) -teknologi er den mest brukte neste generasjons sekvenseringsteknologi i verden. Mer enn 90% av sekvenseringsdataene i verden er generert av Illumina-sekvensering. Det ble opprinnelig utviklet av Shankar Balasubramanian og David Klenerman ved University of Cambridge. De grunnla et selskap kjent som Solexa i 1998. Deretter kjøpte Illumina Solexa i 2007, og raskt forbedret den opprinnelige teknologien. Derfor kalles metoden også Solexa / Illumina sekvenseringsmetode. Den største fordelen med Illumina-sekvensering er at den gir et høyt utbytte av feilfrie lesinger.
Hvordan virker Illumina Sequencing Work
De fire trinnene involvert i Illumina-sekvensering er beskrevet nedenfor.
Trinn 1. Biblioteksforberedelse
- Et sekvenseringsbibliotek fremstilles ved samtidig tagmentation av DNA i korte segmenter av 200-600 basepar ved transposaser i en prosess kjent som tagmentering, etterfulgt av ligering av adapter i både 3'- og 5'-ender av de korte segmentene av DNA.
- Ytterligere motiver som sekvenseringsprimerbindingssted, indeks og en region, som er komplementær til strømningscelloligo, tilsettes til adapteren på begge sider av redusert syklusforsterkning. Tagering og tillegg av motiver er vist i Figur 1.
Figur 1: Tagmentering og tillegg av motiver
Trinn 2. Cluster Generation
- Det forberedte sekvenseringsbiblioteket denatureres og lastes inn i a flytcelle for klyngegenerering. Under klustergenerering er hvert fragment i sekvenseringsbiblioteket isotermt amplifisert. Strømningscellen består av glass som inneholder baner. Hver bane er belagt med to typer oligonukleotider. En type er komplementær til 5'-regionen av de ekstra motivene, og den andre typen er komplementær til 3'-regionen av de ytterligere motiver av det fremstilte bibliotek. Derfor binder disse oligosene til de tilsvarende regioner av DNA i sekvenseringsbiblioteket. Strømningscellen med to typer oligos er vist i figur 2. Den oligo som binder seg til 5'-regionen i sekvenseringsbiblioteket er rosa i farge mens oligoen som binder seg til 3'-regionen i sekvenseringsbiblioteket er grønn i farge.
Figur 2: Flow Cell
- Når det enkeltstrengede sekvenseringsbiblioteket er bundet til oligoen, blir den komplementære streng dannet av DNA-polymerase. Deretter denatureres det resulterende dobbeltstrengede DNA og den opprinnelige streng vaskes bort.
- De klonal amplifikasjon av fragmentet oppnås gjennom broforsterkning. Under denne prosessen vikler strengen over den andre typen oligo på strømningscellen. Så syntetiserer polymerasen den dobbeltstrengede broen. Denatureringen av broen resulterer i to DNA-tråder: både forover og reversstreng på oligos av strømningscellen.
- Broforsterkning gjentas igjen og igjen for å oppnå samtidig millioner av klynger av alle typer fragmenter i sekvenseringsbiblioteket ved klonal amplifisering. Klonal forsterkning er vist i figur 3.
Figur 3: Klonalforsterkning
- Deretter vaskes de omvendte trådene vekk og holder bare de fremadgående strengene på strømningscellen. I foroverstrengen er 3'-enden fri og den er blokkert for å forhindre uønsket priming.
Trinn 3. Sekventering
Første lesning av omvendt sekvens
-
Sekvensering begynner med forlengelse av den første sekvenseringsprimeren. Illumina sekvenseringsmetode bruker modifiserte dNTPer, som inneholder en terminator ved 3'-stillingen av deoksyribose-sukker. Disse dNTPene er også fluorescensmerket i forskjellige farger.
-
Etter tilsetningen av hvert komplementært nukleotid, blir klyngene i strømningscellen observert for utslipp av fluorescens.
-
Etter deteksjon av lys kan fluoroforet vaskes av.
-
Deretter regenereres terminatorgruppen av 3'-stillingen av sukkeret med en hydroksylgruppe, slik at tilsetning av en andre dNTP til vekstkjeden. Denne prosessen er kjent som sekvensering-ved-syntese. Sekvenserings-ved-syntese er vist i figur 4.
Figur 4: Sequencing-by-Synthesis
- Ved ferdigstillelse av syntesen, Først les av omvendt sekvens oppnås og sekvenseringsproduktet vaskes bort.
Indeks 1 Les
- Indeksen 1 primer hybridiseres deretter til klynger for å generere en andre leses på samme måte ved sekvensering-ved-syntese. Sekvenseringsproduktet vaskes bort.
Indeks 2 Les
- Den 3'-enden av klyngen blir da avbeskyttet, slik at hybridiseringen av 3'-enden med den andre typen oligo på strømningscellen (grønn farge). Ved dette blir sekvensen av indeks 2-regionen oppnådd. Sekvenseringsproduktet vaskes bort.
Second Les av fremdriftssekvensen
- Den andre typen oligo blir utvidet med en polymerase som danner en dobbeltstrenget bro. Broen er denaturert og deres 3'-ender er blokkert. Fremstrengen er vasket bort.
- De andre les av fremover-sekvensen oppnås ved sekvensering-ved-syntese ved hybridisering og forlengelse av den andre sekvenseringsprimeren.
Trinn 4. Dataanalyse
- Milliarder av lesene oppnådd ved sekvensering grupperes basert på deres indekssekvenser.
- Deretter er sekvensene med lignende les klynget.
- Fremover og omvendt leser er parret til å danne sammenhengende sekvenser.
- De tvetydige justeringer kan løses ved parrede sekvenser.
- De sammenhengende sekvensene er justert til referansegenomet for variantidentifikasjon.
Følgende video forklarer hele prosessen med Illumina-sekvensering.
Konklusjon
Illumina-sekvensering er en neste generasjons sekvenseringsmetode. Illumina-sekvensering er involvert i fremstillingen av et sekvenseringsbibliotek med 200-600 basepar lange fragmenter av DNA. De fire trinnene som er involvert i Illumina-sekvenseringen, er bibliotekspreparasjon, klyngegenerering, sekvensering og dataanalyse. Siden Illumina-sekvensering gir sekvenser med høy nøyaktighet, er det den allment brukte sekvenseringsmetoden i verden.
Henvisning:
1. "Sequencing by Synthesis (SBS) Technology." Sequencing Technology | Sequencing ved syntese, Tilgjengelig her.
Bilde Courtesy:
1. "DNA Processing Preparation" Av DMLapato - Eget arbeid (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Oligonukleotidkjeder i Flow Cell" Av DMLapato - Eget arbeid, (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
3. "Sequencing by synthesis Reversible terminators" Av Abizar Lakdawalla (talk) - Jeg laget dette arbeidet helt alene av meg selv (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
4. "Cluster Generation" Av DMLapato - Eget arbeid (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
