Hvordan Gel Electrophoresis Separate DNA Fragments

Gelelektroforese er en teknikk som brukes til å separere makromolekyler som DNA, RNA og proteiner. Både DNA- og RNA-molekylene skilles ut fra deres størrelse mens proteiner separeres basert på både størrelse og ladning. Agarosegelelektroforese er teknikken som brukes til å separere både DNA og RNA. Fra 100 bp til 25 kb DNA-fragmenter kan separeres av agarosegelelektroforese. Generelt er DNA positivt ladede molekyler siden de har negative ladninger i deres fosfatgrupper. Dermed migrerer DNA mot den positive elektroden under gelelektroforese.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er Gel Electrophoresis
      - Definisjon, Agarose Gel Electrophoresis, PAGE
2. Hvordan Gel Electrophoresis Separate DNA Fragments
     - Prinsipp for separering av DNA

Nøkkelbegreper: Agarose Gel Elektroforese, Migrert Avstand, DNA, SIDE, Porer, Positiv Elektrode, Størrelse

Hva er Gel Electrophoresis

Gelelektroforese er en teknikk som brukes til å separere fragmenter av makromolekyler som DNA, RNA og proteiner basert på deres størrelse og ladning. Både DNA og RNA har lik negativ ladning gjennom molekylet på grunn av tilstedeværelsen av negativt ladede fosfatgrupper. Derfor, både DNA og RNA migrerer mot den positive elektroden under et elektrisk felt. I tillegg, agarosegelelektroforese er teknikken brukt til å separere DNA og RNA basert på deres størrelse. Separasjonen av DNA-fragmenter ved gelelektroforese er vist i Figur 1.

Figur 1: Separerte DNA-fragmenter

Gelelektroforetisk teknikk som brukes til å separere proteiner er polyakrylamidgelelektroforese (PAGE). Proteinene som brukes i denne teknikken skilles ut fra deres størrelse og ladning. PAGE kan brukes til å separere DNA-fragmenter med baseparnivåforskjeller også, siden separasjonskraften til PAGE er høyere enn den for agaroselelektroforeseen.

Hvordan Gel Electrophoresis Separate DNA Fragments

Under agarosegelelektroforese blandes DNA-prøvene med påføringsfargen og lastes på brønnene i agarosegelen. Lastebufferen inneholder sporingsfarger som visualiserer bevegelsen av DNA-prøven på gelen. Deretter påføres et elektrisk felt på begge ender av gelen. DNA-prøven migrerer mot den positive elektroden. Hastigheten på migrasjonen på det elektriske feltet avhenger av størrelsen på DNA-fragmentet. DNA-molekyler med et stort antall basepar migrerer sakte mens molekyler med færre basepar migrerer raskt gjennom gelen. Derfor tillater gelelektroforese separasjonen av DNA-fragmenter basert på deres størrelse. Dette produserer en serie DNA-fragmenter med størrelser i synkende rekkefølge. Forholdet mellom avstanden for migrasjon og størrelsen på DNA-fragmentet er vist i figur 2.

Figur 2: Forholdet mellom avstanden migrert og størrelsen på DNA-fragmentet

Agarosegelen inneholder like store porer gjennom hvilke DNA-fragmentene migrerer. Derfor flytter små DNA-fragmenter raskt gjennom porene, men store DNA-fragmenter tar litt tid å migrere gjennom dem. Etter å ha kjørt en betydelig avstand, blir agarosegelen visualisert under UV. Siden agarosegelen tilsettes med DNA-fargestoffer under UV-kalt etidiumbromid, sammenføyes DNA-fragmenter med flekken som muliggjør visualisering. For bestemmelse av størrelsen på DNA-fragmentet, blir prøvene kjørt sammen med en stige som inneholder en rekke DNA-fragmenter med kjent størrelse.

Konklusjon

Gelelektroforese er en teknikk som brukes til å separere DNA, RNA eller proteinmolekyler basert på deres størrelse og ladning. Agarosegelelektroforese er den allment brukte teknikken for separasjon av DNA basert på molekylets størrelse. Under migrasjonen av DNA-molekyler gjennom porene i agarosegelen, separeres de på grunnlag av størrelsen.

Henvisning:

1. "Gelelektroforese". Khan Academy, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis" Av Rainis Venta - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Gel Electrophoresis" Av Mckenzielower - Eget arbeid (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia