Forskjell mellom reversfase og hydrofob interaksjonskromatografi
Share
De hovedforskjell mellom reversfase og hydrofob interaksjonskromatografi er at reversfasekromatografi (RPC) bruker et mer hydrofobt medium, som fører til sterkere interaksjoner mens hydrofobisk interaksjonskromatografi (HIC) bruker et mindre hydrofobt medium når det sammenlignes med mediet i reversfasekromatografi.
Omvendt fasekromatografi og hydrofob interaksjonskromatografi er to kromatografiske teknikker som avhenger av samspillet mellom hydrofobe overflater av et kromatografisk medium og de hydrofobe flekkene på overflaten av biomolekyler.
Nøkkelområder dekket
1. Hva er Reverse Phase Chromatography
- Definisjon, trinn, applikasjoner
2. Hva er hydrofob interaksjonskromatografi
- Definisjon, trinn, applikasjoner
3. Hva er likhetene mellom reversfasekromatografi og hydrofob interaksjonskromatografi
- Oversikt over vanlige funksjoner
4. Hva er forskjellen mellom reversfasekromatografi og hydrofob interaksjonskromatografi
- Sammenligning av nøkkelforskjeller
Nøkkelord
Hydrofob Interaksjonskromatografi, HIC, Media, Reverse Phase Chromatography, RPC
Hva er Reverse Phase Chromatography
Omvendt fasekromatografi (RPC) er en kromatografisk teknikk som brukes i rensing og analyse av biomolekyler, så som proteiner, peptider og oligonukleotider. Det gir en høyoppløselig adskillelse og er ideell for peptid kartlegging og renhetskontroll. RPC brukes hyppigere i den endelige poleringen av peptider og oligonukleotider.
To hovedtyper av hydrofobe medier kan brukes som den stasjonære fasen: silikakuler dekket med karbonkjeder eller nakne hydrofobe polymerer. En kolonne er pakket med det hydrofobe mediet i en form av pakket seng på hvilken prøven påføres. Et ionepareringsmiddel slik som trifluoreddiksyre (TFA) kan tilsettes i mobilfasen for å forbedre dannelsen av hydrofobe interaksjoner. En organisk modifikator som 5% acetonitril brukes i begynnelsen, og eluering kan initieres med den økende prosent av acetonitril.
Figur 1: Omvendt fase kromatografi teori
Biomolekyler som er mindre hydrofobe / mer polare vil eluere først mens de mer hydrofobe molekylene vil eluere senere. RPC er kromatografisk teknikk med høyeste oppløsning.
Hva er hydrofob interaksjonskromatografi
Hydrofob interaksjonskromatografi (HIC) er den andre teknikken som brukes ved separering av biomolekyler basert på hydrofobiciteten under moderate forhold. Det er en ideell teknikk for rensing av proteiner når prøvene må underkastes ammoniumsulfatutfelling i den første prøvekonsentrasjon og opprydding. Det forhøyede saltnivået under ammoniumsulfatutfelling øker samspillet mellom hydrofobe komponenter.
Figur 2: Effekt av høy saltkoncentrasjon på hydrofobe interaksjoner
Det hydrofobiske medium av HIC består av en inert matrise av sfæriske partikler belagt med ligander som inneholder alkyl- eller arylgrupper. De hydrofobe interaksjonene oppstår under moderat høye saltkonsentrasjoner (typisk 1-2 M ammoniumsulfat eller 3 M NaCl). Startbufferen sikrer bindingen av proteiner av interesse for mediet, mens du fjerner urenheter. Elueringsbufferen inneholder lavsaltskonsentrasjon, svekker samspillet mellom proteiner og den stasjonære fasen.
Likheter mellom reversfasekromatografi og hydrofobisk interaksjonskromatografi
- Omvendt fase og hydrofob interaksjonskromatografi er to teknikker anvendt ved separering av biomolekyler basert på deres hydrofobicitet.
- Den mobile fasen av begge teknikker er enten vann eller et organisk løsningsmiddel.
- De bruker pakket senger.
- Startbuffer sikrer binding av ønskede molekyler til kolonnen.
- Molekyler med lavest hydrofobicitet kan eluere først mens flere hydrofobe molekyler kan eluere senere.
- Det endelige vaskepunktet eluerer de mest tettbundne molekylene.
- Oppløsningen av begge teknikkene er en kombinasjon av selektiviteten (graden av separasjon mellom toppene), effektivitet (evnen til å produsere smale, symmetriske topper) av teknikken, prøvens masse og retensjonstiden.
Forskjellen mellom reversfasekromatografi og hydrofob interaksjonskromatografi
Definisjon
Omvendt fasekromatografi (RPC) refererer til den høyeste oppløsningsseparasjonsteknikken basert på hydrofobiciteten til molekylene i en blanding, mens hydrofob interaksjonskromatografi (HIC) refererer til en type separasjonsteknikk basert på hydrofobiciteten, men opererer under relativt milde forhold.
hydrofobitet
RPC opererer under mer hydrofobe forhold mens HIC opererer under relativt milde hydrofobe forhold.
interaksjoner
Omvendt fasekromatografi fører til sterkere interaksjoner mellom molekyler og den stasjonære fase som må reverseres under eluering ved hjelp av en organisk modifikator mens HIC fører til moderat høye interaksjoner mellom den stasjonære fase og molekylene.
Hydrofobe medier
RPC bruker enten silisiumdioksydperler dekket med karbonkjeder eller nakne hydrofobe polymerer mens HIC bruker en inert matrise av sfæriske partikler belagt med ligander som inneholder alkyl- eller arylgrupper.
Startbuffer
Startbufferen i RPC bruker trifluoreddiksyre (TFA) mens startbufferen til HIC bruker moderat høye saltkonsentrasjoner.
eluering
Den økte prosentandel av acetonitril begynner elueringen i RPC mens den avtagende saltkonsentrasjon begynner elueringen i HIC.
Vedtak
Omvendt fasekromatografi er kromatografisk teknikk med høyest oppløsning mens oppløsningen av HIC er lav sammenlignet med RPC.
applikasjoner
RPC brukes i separasjon av proteiner, peptider og oligonukleotider mens HIC hovedsakelig brukes i rensing av proteiner.
Konklusjon
Omvendt fasekromatografi er kromatografisk teknikk med høyeste oppløsning, som opererer under svært hydrofobe forhold. Men HIC opererer under moderate hydrofobiske forhold. RPC og HIC er de to typer separasjonsteknikker basert på hydrofobiciteten. Hovedforskjellen mellom RPC og HIC er graden av hydrofobicitet som brukes i hver teknikk.
Henvisning:
1. Hydrofob interaksjon og reversert fasekromatografi: prinsipper og metoder. GE Healthcare, 2006. Tilgjengelig her
Bilde Courtesy:
1. "Reverse Phase Gradient Elution Schematic" Av Nategm - Eget arbeid (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Hicsalt" Av Daliak på engelskboksen - Overført fra en.wikibooks til Commons. (Public Domain) via Commons Wikimedia
