Forskjellen mellom PCR og QPCR

Hovedforskjell - PCR vs QPCR

PCR (polymerasekjedereaksjon) og qPCR (kvantitativ PCR) er to teknikker som brukes i bioteknologi for å amplifisere DNA for forskjellige formål. PCR er en relativt enkel teknikk. qPCR er også kjent som sanntids-PCR eller digital PCR. De hovedforskjell mellom PCR og qPCR er det PCR er en kvalitativ teknikk, mens qPCR er en kvantitativ teknikk. PCR gjør det mulig å lese resultatet som "tilstedeværelse eller fravær". Men i qPCR, kvantifiseres mengden DNA amplifisert i hver syklus. Hvis RNA brukes i PCR, er teknikken kjent som RT-PCR (revers transkripsjons-PCR), og hvis RNA brukes i qPCR, er teknikken kjent som qRT-PC.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er PCR
     - Definisjon, prosesser, bruksområder
2. Hva er QPCR
     - Definisjon, prosesser, bruksområder
3. Hva er likhetene mellom PCR og QPCR
     - Oversikt over vanlige funksjoner
4. Hva er forskjellen mellom PCR og QPCR
     - Sammenligning av nøkkelforskjeller

Nøkkelbetingelser: Agarosegel-elektroforese, amplikoner, DNA-polymerase, fluorescerende fargestoff, PCR, Probes, qPCR, RT-qPCR

Hva er PCR

PCR refererer til en teknikk i bioteknologi som tillater analyse av en kort sekvens av DNA ved å amplifisere et valgt segment av DNA. Det er relativt sensitiv metode, da det kreves svært små volumer ved en enkelt reaksjon. Teknikken er basert på DNA-polymeras evne til å syntetisere nye DNA-strengene til den tilbudte malestrengen på en komplementær måte. Reaksjonsblandingen av PCR er sammensatt av DNA-polymerase, DNA-nukleotider, primere, DNA-malen som skal amplifiseres, og magnesium. Amplifiseringen utføres i en termocykler. DNA-polymerase bør være varmebestandig, da høye temperaturer blir brukt i denne reaksjonen. De to typer DNA-polymeraser som brukes i PCR er Taq DNA-polymerase og pfu DNA-polymerase. Taq DNA-polymerase er mye brukt i PCR.

DNA-polymerase krever en eksisterende DNA-streng ved 3'-enden for å syntetisere en ny streng. Derfor blir en oligonukleotidprimer tilsatt til reaksjonsblandingen for initiering av DNA-syntese. Kravet til en primer i PCR tillater forsterkning av bare en bestemt region i malen. Målsekvensen flankeres av forover- og revers-primere. På slutten av en PCR, nye kopier av en bestemt DNA-sekvens, som kalles amplikoner, akkumuleres i milliarder. Komponentene i PCR bør optimaliseres på en slik måte at PCR-ytelsen forbedres, samtidig som feilene reduseres. Den vanlige PCR-reaksjonen er vist i Figur 1.

Figur 1: PCR

Trinn av PCR

De tre trinnene i en PCR er beskrevet nedenfor.

1. denaturering - Den dobbeltstrengede DNA-malen separeres i to enkle tråder ved oppvarming til 94-95 ° C.
2. annealing - Fremover og revers primere binder seg til komplementære sekvenser i malen. Temperaturen avhenger av smeltetemperaturen til primerkombinasjonen.
3. Primer forlengelse - DNA-polymeraseenzym utvider hver primer ved deres 3'end ved å tilsette komplementære baser til den voksende streng. Den optimale temperaturen på Taq polymerase, dvs. 72 ° C, brukes som temperaturen i forlengelsestrinnet. Tiden for forlengelsen avhenger av antall basepar i malstrengen.

De tre trinnene gjentas i 28-35 ganger. Agarosegelelektroforese brukes i størrelsesfraksjonering av PCR-produkter. Produktet er farget med etidiumbromid og observeres under UV. PCR-produktet eller det amplifiserte DNA kan anvendes i kloning, sekvensering eller genotyping.

Hva er QPCR

QPCR refererer til en teknikk i bioteknologi som tillater deteksjon, karakterisering og kvantifisering av nukleinsyrer for forskjellige anvendelser. Derfor er det en type kvantitativ PCR. Både DNA og RNA kan brukes som qPCR. Hvis RNA brukes som mal, bør det først reverseres transkribert til cDNA. Således er denne typen qPCR kjent som RT-qPCR. Den tradisjonelle PCR utføres for cDNA eller vanlig DNA-prøve. I qPCR brukes imidlertid fluorescerende fargestoffer til å merke PCR-produktet i hvert trinn i PCR-syklusen. Dette gjør det mulig å samle data etter hvert som PCR utvikler seg, slik at kvantifiseringen av amplikonene under eksponensiell fase av PCR. Den viktigste typen fargestoff som brukes i qPCR er SYBR Green. Fargen binder seg til det dobbeltstrengede DNA. Da fluorescensen økes proporsjonalt med mengden amplifisert DNA, kan kvantifiseringen gjøres i "sanntid". Den største ulempen ved bruken av fargestoffet er at den tillater kvantifisering av et bestemt produkt i prøven. I tillegg til fargestoffer kan prober også brukes i kvantifiseringsprosessen. TaqMan-prober er en av hovedtyper av oligonukleotidprober som brukes i qPCR, og prosessen med fluorescensemisjon er vist i figur 2.

Figur 2: TaqMan Probe

Prober kan utformes på en slik måte at det oppdages flere PCR-produkter innenfor samme prøve. TaqMan-sonden er en av hovedtyper av hydrolyseprober; inkorporeringen av denne sonden i PCR-produktet utsetter fluoroforen, som emitterer fluorescensen. Fluorescerende fargestoffer er mer spesifikke for PCR-produktet. Derfor blir de brukt i de fleste diagnostiske analyser for å oppdage PCR-produktet. 

Likheter mellom PCR og QPCR

• PCR og qPCR er to typer teknikker som brukes i bioteknologi for å amplifisere DNA for forskjellige formål.
• Den tradisjonelle polymerasekjedereaksjonen utføres som kjerneteknikken i både PCR og qPCR.
• RNA kan brukes i både PCR og qPCR ved å bruke revers transkripsjon som den første reaksjonen.

Forskjellen mellom PCR og QPCR

Definisjon

PCR: PCR er en teknikk i bioteknologi som tillater analyse av en kort sekvens av DNA ved å amplifisere et utvalgt segment av DNA.

QPCR: QPCR er en teknikk i bioteknologi som tillater deteksjon, karakterisering og kvantifisering av nukleinsyrer for forskjellige anvendelser.

Kvantitativ / Kvalitativ

PCR: PCR er kvalitativ teknikk.

QPCR: QPCR er en kvantitativ teknikk.

Påvisning av produktet

PCR: Produktet detekteres av agarosegelelektroforeseen i PCR.

QPCR: Produktet kan detekteres i hver amplifikasjons syklus i qPCR.

Innsamling av data

PCR: Dataene samles ved slutten av reaksjonen i PCR.

QPCR: Dataene samles i eksponensiell fase av reaksjonen i qPCR.

Vedtak

PCR: PCR har en svært dårlig oppløsning.

QPCR: QPCR har en meget høy oppløsning.

Fargestoffer

PCR: PCR bruker etidiumbromid til å plette produktet under PCR.

QPCR: QPCR bruker fluorescerende fargestoffer for å oppdage produktet.

Tid

PCR: PCR er en mer tidkrevende metode.

QPCR: QPCR er mindre tidkrevende.

RNA

PCR: RT-PCR er typen PCR som bruker RNA som mal.

QPCR: RT-qPCR er typen qPCR som bruker RNA som mal.

rolle

PCR: PCR brukes til å detektere nærvær eller fravær av visse genomiske fragmenter.

QPCR: QPCR brukes til å kvantifisere et bestemt fragment i en prøve.

Konklusjon

PCR og qPCR er to typer teknikker som brukes i bioteknologi for å amplifisere DNA for forskjellige formål. PCR er den tradisjonelle amplifikasjonsmetoden som brukes til å identifisere tilstedeværelsen eller fraværet av et DNA-fragment. QPCR brukes til å kvantifisere et bestemt fragment i en prøve. Således er PCR en kvalitativ teknikk mens qPCR er en kvantitativ teknikk. Dette er hovedforskjellen mellom PCR og qPCR.

Henvisning:

1. "QPCR vs Digital PCR vs Tradisjonell PCR." Thermo Fisher Scientific, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "PCR" Av Madprime - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Taqman" Av bruker: Braindamaged - Egentlig arbeid av den opprinnelige opplasteren (Public Domain) via Commons Wikimedia