Forskjellen mellom PCR og DNA-sekvensering
Share
Nøkkelforskjell - PCR vs DNA-sekvensering
PCR og DNA-sekvensering er to viktige teknikker innen molekylærbiologi. Polymerase Chain Reaction (PCR) er prosessen som skaper et stort antall kopier av et DNA-fragment. DNA-sekvensering er teknikken som resulterer i den nøyaktige rekkefølgen av nukleotidene i et gitt DNA-fragment. Dette er nøkkeldifferansen mellom PCR og DNA-sekvensering. PCR er et av hovedtrinnene involvert i DNA-sekvensering.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er PCR
3. Hva er DNA-sekvensering
4. Side ved side-sammenligning - PCR vs DNA-sekvensering
5. Sammendrag
Hva er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en DNA-amplifikasjonsteknikk som brukes i molekylærbiologi. Det produserer tusenvis til millioner av kopier av et bestemt DNA-fragment. Denne metoden ble utviklet av Kary Mullis i 1983. I denne teknikken tjener fragmentet av DNA som skal amplifiseres som malen og DNA-polymeraseenzymet til å legge komplementære nukleotider til primeren som er tilgjengelig i PCR-blandingen. På slutten av PCR-reaksjonen syntetiseres mange kopier av prøve-DNA.
Det er forskjellige komponenter i PCR-blandingen, inkludert DNA, DNA polymerase (Taq polymerase), primere (fremover og revers primere), nukleotider (byggeblokker av DNA) og en buffer. PCR skjer i en PCR-maskin, og den korrekte PCR-blandingen skal lastes inn i maskinen, og det riktige programmet skal kjøres. Denne teknikken gjør det mulig å produsere tusenvis til millioner av kopier av en bestemt del av DNA fra en svært liten mengde DNA.
PCR-reaksjoner skjer på en syklisk måte for å produsere den synlige mengden PCR-produkter på en gel. Det er tre hovedtrinn involvert i en PCR-reaksjon, nemlig denaturering, primerglødning og strengforlengelse som vist i figur 01. Disse tre trinnene forekommer ved tre forskjellige temperaturer. DNA eksisterer i dobbeltstrenget form ved hydrogenbindinger mellom komplementære baser. Før implikasjon bør dobbeltstrenget DNA skilles fra hverandre. Det gjøres ved å gi høy temperatur. Ved høy temperatur denaturerer dobbeltstrenget DNA til enkle tråder. Da skal primrene komme nærmere de flankerende ender av det spesifikke fragmentet eller DNA-genet. Primer er et kort stykke enkeltstrenget DNA som er komplementært til målsekvensen. Fremover og revers primere anneal med komplementære baser ved flankerende ender av den denaturerte prøve DNA ved annealingstemperaturen. Primers bør være varmebestandig. Når primere anneal med prøve-DNA initierer taq polymerase enzym syntesen av de nye strengene ved å tilsette nukleotider som er komplementære til mål-DNA. Taq-polymerase er et varmestabilt enzym isolert fra en termofil bakterie som kalles Thermus aquaticus. PCR-buffer opprettholder de optimale forholdene for taq-polymerase-virkningen. Disse tre stadier av PCR-reaksjoner gjentas for å produsere den nødvendige mengde PCR-produkt. Etter hver PCR-reaksjon dobles antallet av DNA-kopien. Derfor kan en eksponensiell amplifikasjon observeres i PCR. PCR-produkter kan observeres ved hjelp av gelelektroforese og kan renses for videre studier.
Figur 01: Hovedtrinn av en PCR-reaksjon
PCR er et verdifullt verktøy i medisinsk og biologisk forskning. PCR har en spesiell verdi i rettsmedisin, siden den kan amplifisere DNA for studier fra de små prøvene fra kriminelle og lage rettsmedisinske DNA-profiler. PCR er mye brukt i mange områder av molekylærbiologi, inkludert genotyping, genkloning, mutasjonsdeteksjon, DNA-sekvensering, DNA-mikroarrays og faderskapstesting, osv..
Figur 02: Polymerase Chain Reaction
Hva er DNA-sekvensering?
DNA-sekvensering er bestemmelsen av en nøyaktig rekkefølge av nukleotidene - adenin, guanin, cytosin og tymin i et gitt DNA-fragment. Genetisk informasjon lagres i DNA-sekvensene ved å bruke den riktige rekkefølgen av nukleotidene. Derfor er det viktig å finne nøyaktig rekkefølgen av nukleotidene i et DNA-fragment om generens struktur og funksjon.
DNA sekvenseringsprotokoll innebærer forskjellige prosesser. Det første trinnet er isolering av interessert DNA eller genomisk DNA av en organisme. Ved anvendelse av PCR (som beskrevet ovenfor), bør den ønskede regionen av DNA amplifiseres. Amplifisert PCR-produkt skal separeres ved gelelektroforese og renses. Forsterkede fragmenter blir servert som maler for sekvensering. Sekvensering kan gjøres enten etter Sanger-sekvensering eller høy gjennomstrømnings-sekvenseringsmetode. Sanger-sekvensering krever kapillærelektroforese av resulterende DNA-fragmenter. Bestemmelse av riktig nukleotidordre kan gjøres ved manuell avlesning av autoradiografer eller ved bruk av automatiserte DNA-sekvenser.
Gen-sekvensering bidro til menneskelig genomprosjekt og lette kartlegging av det humane genomet i 2003. I rettsmedisinene aktiverte DNA-sekvensering identifisering av individer som viser unike DNA-sekvenser og identifiserer de kriminelle. I medisin kan DNA-sekvensering brukes til å oppdage generene som er ansvarlige for genetiske og andre sykdommer, finne defektegener og erstatte dem med riktige gener. I landbruket brukes DNA-sekvenseringsinformasjon for enkelte mikroorganismer til å produsere transgene avlinger med økonomisk ønskede egenskaper.
Figur 03: DNA-sekvensering
Hva er forskjellen mellom PCR og DNA-sekvensering?
PCR vs DNA-sekvensering | |
| PCR-prosessen skaper tusenvis til millioner av kopier av det interesserte DNA-fragmentet. | DNA-sekvensering er prosessen med å bestemme nøyaktig rekkefølgen av nukleotidene i et gitt DNA-fragment. |
| Utfall | |
| PCR skaper tusenvis til millioner av kopier av et bestemt DNA-fragment | Dette resulterer i riktig rekkefølge av basene i et bestemt DNA-fragment. |
| Engasjement av ddNTPs | |
| PCR krever ikke ddNTP. Den bruker dNTPs. | DNA-sekvensering krever at ddNTPer terminerer strengdannelse. |
Oppsummering - PCR vs DNA-sekvensering
PCR og DNA-sekvensering er svært viktige verktøy i mange områder av molekylærbiologi. Amplifisering av DNA-fragmentene gjøres ved PCR-teknikken, mens den korrekte rekkefølgen av nukleotidene i et DNA-fragment bestemmes av DNA-sekvenseringen. Dette er forskjellen mellom PCR og DNA-sekvensering.
Henvisning:
1. "Polymerase Chain Reaction (PCR)." National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine, n.d. Web. 21. februar 2017.
2. Shendure, Jay og Hanlee Ji. "Neste generasjon DNA-sekvensering." Nature News. Nature Publishing Group, 9. oktober 2008. Web. 21. februar 2017
Bilde Courtesy:
1. "PCR-trinn" Av Tinojasontran - Eget arbeid (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Polymerase chain reaction" Av Enzoklop - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "DNA-sekvens" Av Sjef - Eget arbeid (Public Domain) via Commons Wikimedia
