Forskjellen mellom DNA og RNA-ekstraksjon

De hovedforskjell mellom DNA og RNA-ekstraksjon er at pH-nivået på DNA-ekstraksjon er pH 8 mens pH-nivået av RNA-ekstraksjon er pH 4,7. DNA har en tendens til å denaturere og bevege seg til den organiske fase ved sur pH. Ved alkalisk pH undergår RNA alkalisk hydrolyse på grunn av tilstedeværelsen av 2'OH i ribosukker.  

DNA- og RNA-ekstraksjon er de to prosedyrene som er involvert i isolering og rensing av nukleinsyrer fra vevscellene. Begge prosedyrene består av tre trinn. God kvalitet DNA og RNA spiller en kritisk rolle i molekylærbiologi, bioteknologi, genomforskning og epidemiologi eksperimenter. 

Nøkkelområder dekket 

1. Hva er DNA-ekstraksjon
     - Definisjon, Prosedyre
2. Hva er RNA-ekstraksjon
     - Definisjon, Prosedyre
3. Hva er likhetene mellom DNA og RNA-ekstraksjon
     - Oversikt over vanlige funksjoner
4. Hva er forskjellen mellom DNA og RNA-ekstraksjon
     - Sammenligning av nøkkelforskjeller

Nøkkelbetingelser: Cell Lysis, Denaturering av Proteiner, DNA-ekstraksjon, pH, Nedbør, RNA-ekstraksjon

Hva er DNA-ekstraksjon

DNA-ekstraksjon er isolasjons- og rensingsprosedyren av DNA. DNA kan isoleres fra blod, frosne vevsprøver eller parafinvevsblokker. De tre trinnene med DNA-ekstraksjon er cellelys, isolering av DNA og utfelling. Under cellelys brytes cellemembranbarrierer som cellemembranen og membranene i kjernen for å eksponere DNA. Det neste trinnet er fjerning av membranlipider fra prøven. Endelig innebærer utfelling av DNA fjerning av DNA-assosierte proteiner ved protease og fjerning av RNA ved RNase.

Figur 1: DNA-ekstraksjonsprosedyre

Grunnleggende protokoller for DNA-ekstraksjon

Vist nedenfor er de grunnleggende protokollene for DNA-ekstraksjon. 

1. Celllysis med cellelysisbufferen til lyscellemembraner

2. Lipider brytes ned med vaskemidler og overflateaktive stoffer

3. Fordøying av proteiner ved å legge til protease

4. Fordøyelse av RNA ved å tilsette RNase

5. Separering av celleavfall, fordøyede proteiner, lipider og RNA ved tilsetning av konsentrert salt etterfulgt av sentrifugering

6. Etanolutfelling av DNA med iskold etanol eller isopropanol. Jonstyrken av natriumacetat kan brukes til å forbedre nedbør. Det utfelte DNA fremstår som tråder i den endelige løsningen.

Figur 2: Ekstraheret DNA

Fenol-kloroformekstraksjon kan også brukes til å separere DNA fra proteiner. Her denerer fenol proteiner i prøven, og DNA forblir i den vandige fase ved slutten av ekstraksjonen. Og i den organiske fasen finner du de denaturerte proteiner. En annen metode for å ekstrahere DNA er minikolonnrensningen. Her er bindingen av DNA i kolonnen avhengig av pH og saltkonsentrasjonen av bufferen. 

Hva er RNA-ekstraksjon 

RNA-ekstraksjon refererer til prosessen med rensing av RNA fra prøver. Den konvensjonelle metoden for RNA-ekstraksjon kalles Guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-ekstraksjon. Guanidiniumtiocyanat denaturerer proteiner. Dessuten forstyrrer det hydrogenbindingen av vannmolekyler og tjener som det kaotropiske middel. En spesiell reagens brukes i RNA-ekstraksjonen kalt Tri-reagens. Den inneholder guanidiniumtiocyanat, fenol og natriumacetat. Hensikten med de grunnleggende trinnene for RNA-ekstraksjon er lik den i DNA-ekstraksjon. Protokollen for RNA-ekstraksjon er beskrevet nedenfor. 

1. Celler vaskes med iskald PBS for å opprettholde cellens osmolaritet. 

2. Aspirer cellene og homogeniser prøven med Tri-reagens.  

3. Tilsett kloroform og rist. 

4. Sentrifugering kan resultere i tre lag. Topplaget er det vandige laget, som er klart. Mellomlaget eller interfasen inneholder det utfelte DNA. Bunnlaget er det organiske laget, som er rosa. 

5. Fjern det vandige laget og tilsett isopropanol. Sentrifugering kan resultere i en pellet.  

6. Vask pellet med 75% etanol. Luft tørr pellet. 

7. Oppløs pellet med TE-buffer eller vann.

Figur 3: Fenol-kloroform-ekstraksjon av RNA

RNA-ekstraksjon utføres vanligvis ved pH under 7. Ved alkalisk pH er RNA mer tilbøyelig til å bli nedbrytet ved alkalisk hydrolyse på grunn av tilstedeværelsen av en OH-gruppe ved 2'-stillingen av ribosukker. I tillegg har RNA en tendens til å forbli i den vandige fase ved sur pH. På den annen side har DNA en tendens til å denaturere og bevege seg inn i den organiske fase ved sur pH. Derfor kan DNA-ekstraksjon utføres ved ca. pH 8. DNA består av deoksyribosesukker og undergår ikke alkalisk hydrolyse.  

Likheter mellom DNA og RNA-ekstraksjon 

• DNA- og RNA-ekstraksjon er prosedyrene involvert i isolering og rensing av nukleinsyrer fra biologiske prøver. 
• Begge prosedyrene involverer cellelys, rensing av nukleinsyrer fra rusk og tilhørende proteiner og fremstilling av ekstraktene. 
• For begge prosedyrer må du opprettholde kalde forhold i hele. 
• Involver sentrifugering ved separering av komponenter i blandingen. 
• Trenger å inaktivere aktiviteten til nukleaseenzymer under begge prosedyrene. 
• Fenol-kloroformekstraksjon er et av de kritiske trinnene i begge typer ekstraksjoner. 
• Guanidiniumtiocyanat kan brukes til å beskytte nukleinsyrer.  
• Nedbør av RNA kan gjøres med isopropanol. 
• Jonstyrken av natriumacetat brukes til å forbedre utfelling av nukleinsyrer.  
• Prøvene kan kvantifiseres ved å måle OD ved 260 nm. 

Forskjellen mellom DNA og RNA-ekstraksjon 

Definisjon 

DNA-ekstraksjon: Isolasjon og rensingsprosedyre av DNA

RNA-ekstraksjon: Prosess for rensing av RNA fra prøver

Type Nucleic Acid Extracted 

DNA-ekstraksjon: DNA 

RNA-ekstraksjon: RNA 

pH- 

DNA-ekstraksjon: Ferdig til 8 

RNA-ekstraksjon: Ferdig til 4.7 

Steps 

DNA-ekstraksjon: Bryte cellemembranene eller cellelyse, fjerne membranlipidene og utfelle DNA 

RNA-ekstraksjon: Celllysis, guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformekstraksjon, fremstilling med isopropanol 

Bruk av DEPC-behandlet vann 

DNA-ekstraksjon: Ingen 

RNA-ekstraksjon: Alle reagenser fremstilles med DEPC-behandlet vann

Oppbevaring 

DNA-ekstraksjon: DNA kan ekstraheres tidligere og lagres i batcher

RNA-ekstraksjon: RNA-ekstraksjon er gjort like før nedstrøms prosedyrer

Langsiktig lagring 

DNA-ekstraksjon: Ved -20 ° C

RNA-ekstraksjon: Ved -80 ° C 

Konklusjon 

DNA-ekstraksjon utføres ved pH 8. DNA har en tendens til å bevege seg til den organiske fase da denaturerer ved sur pH. Men RNA-ekstraksjon utføres ved lav pH for å forhindre nedbrytning ved alkalisk hydrolyse. Det grunnleggende formålet med trinnene i både DNA- og RNA-ekstraksjon er tilsvarende. Hovedforskjellen mellom DNA og RNA-ekstraksjon er pH-betingelsene som brukes i hver type ekstraksjon. 

Henvisning:

1. "Grunnleggende om DNA-ekstraksjon." Alaska BioPREP Virtual Textbook, Alaska BioPREP University of Alaska Fairbanks, tilgjengelig her
2. "RNA-isolasjon og omvendt transkripsjonsprotokoll: celler i kultur". Abcam, tilgjengelig her

Bilde Courtesy:

1. "Figur 17 01 02" Av CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia  
2. "DNA-ekstraksjon" av Joo Nath - eget arbeid (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia  
3. "PhOH-CHCl3-ekstraksjon" Av Squidonius (talk) - Eget arbeid (Originalt tekst: selvfremstilt) (Public Domain) via Commons Wikimedia