Forskjell mellom NGS og Sanger Sequencing
Share
Nøkkelforskjell - NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) og Sanger Sequencing er to typer nukleotidsekvenseringsteknikker utviklet over tid. Sanger-sekvenseringsmetode ble mye brukt i mange år, og NGS erstattet det nylig på grunn av fordelene. Hovedforskjellen mellom NGS og Sanger Sequencing er det NGS arbeider på prinsippet om sekvensering av millioner av sekvenser samtidig på en rask måte gjennom et sekvenseringssystem mens Sanger-sekvenseringen virker på hovedmannen av kjedeavslutning på grunn av selektiv inkorporering av dideoxynukleotider ved DNA-polymeraseenzym under DNA-replikasjon og resulterende fragmentseparasjon ved kapillær elektroforese.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er nukleotidsekvensering
3. Hva er NGS
4. Hva er Sanger Sequencing
5. Side ved side sammenligning - NGS vs Sanger Sequencing
6. Sammendrag
Hva er nukleotidsekvensering?
Genetisk informasjon lagres i nukleotidsekvensene av DNA eller RNA av en organisme. Prosessen med å bestemme riktig rekkefølge av nukleotider (ved bruk av fire baser) i et gitt fragment (i et gen, klynge av gener, kromosom og komplett genom) er kjent som nukleotidsekvensering. Det er svært viktig i genomiske studier, rettsmedisinske studier, virologi, biologisk systematisk, medisinsk diagnose, bioteknologi og på mange andre områder for å analysere generens struktur og funksjon. Det finnes ulike typer sekvenseringsmetoder utviklet av forskere. Blant dem, Sanger-sekvensering utviklet av Frederick Sanger i 1977 ble mye brukt og popularisert for en lengre periode til Neste generasjons sekvensering erstattet den.
Hva er NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) er et begrep som brukes til å referere til moderne high-throughput sekvenseringsprosesser. Den beskriver en rekke forskjellige moderne sekvenseringsteknologier som revolusjonerte genomiske studier og molekylærbiologi. Disse teknikkene er Illumina-sekvensering, Roche 454-sekvensering, Ion Proton-sekvensering og SOLiD-sekvensering (Sequencing by Oligo Ligation Detection). NGS-systemer er raskere og billigere. Fire hoved DNA-sekvenseringsmetoder brukes i NGS-systemer nemlig; pyrosequencing, sekvensering ved syntese, sekvensering ved ligering og ion-halvleder-sekvensering. Et stort antall DNA- eller RNA-tråder (millioner) kan sekvenseres parallelt. Det muliggjør sekvensering av hele genomet av organismer innen kort tid, i motsetning til Sanger-sekvensering som tar lengre tid.
NGS har mange fordeler i forhold til konvensjonell sekvensering av Sanger-metoden. Det er en høyhastighets, mer nøyaktig og kostnadseffektiv prosess som kan utføres med en liten prøvestørrelse. NGS kan brukes i metagenomiske studier, ved gjenkjenning av variasjoner innenfor et enkelt genom som følge av innsetting og deletjoner etc. og i analysen av genuttrykk.
Figur_1: Utviklingen i NGS-sekvensering
Hva er Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing er en sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for å bestemme nøyaktig nukleotidordre av et gitt DNA-fragment. Det er også kjent som kjede terminering sekvensering eller Dideoxy-sekvensering. Arbeidsprinsippet for denne metoden er terminering av strengsyntesen ved selektiv inkorporering av en kjedeavslutende dideoxynukleotid (ddNTP) slik som ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP ved DNA-polymerase under replikering av DNA. Normale nukleotider har 3'-OH-grupper for dannelse av en fosfodiesterbinding mellom tilstøtende nukleotider for å fortsette strengdannelsen. Imidlertid mangler ddNTPs denne 3'-OH-gruppen og kan ikke danne fosfodiesterbindinger mellom nukleotider. Derfor er kjedeforlengingen opphørt.
I denne metoden tjener det enkeltstrengede DNA som skal sekvenseres som malstrengen for in vitro DNA syntese. Andre krav er oligonukleotidprimer, deoksynukleotidprekursorer og DNA-polymeraseenzym. Når de flankerende ender av målfragmentet er kjent, kan primere enkelt utformes for DNA-replikasjon. Fire separate DNA syntese reaksjoner utføres i fire separate rør. Hvert rør har separate ddNTPer, sammen med andre krav. Fra det spesifikke nukleotid tilsettes en blanding av dNTP og ddNTP. På samme måte utføres fire separate reaksjoner i fire rør med fire blandinger. Etter reaksjonene utføres deteksjon av DNA-fragmenter og omdannelse av fragmentmønsteret til sekvensinformasjon. Resulterende DNA-fragmenter blir varmedetert og separert ved gelelektroforese. Hvis radioaktive nukleotider blir brukt, kan båndmønsteret i polyakrylamidgelen visualiseres ved autoradiografi. Når denne metoden bruker de fluorescensmerkede dideoxynukleotidene, kan den reduseres ned av gelen som leses og føres gjennom en stråle av laser som detekteres av fluorescerende detektoren. For å unngå feil som kan oppstå når en sekvens leses av øyet og skriver manuelt inn i en datamaskin, utviklet denne metoden til bruk av automatisert sequencer kombinert med datamaskinen.
Dette er metoden som brukes til å sekvensere DNA fra Human Genome-prosjektet. Denne metoden er fortsatt i bruk med avanserte modifikasjoner fordi den gir nøyaktig sekvensinformasjon til tross for å være en kostbar og sakte prosess.
Figur_2: Sanger-sekvensering
Hva er forskjellen mellom NGS og Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing | |
| Next Generation Sequencing (NGS) refererer til moderne high-throughput sekvenseringsprosesser. Den beskriver en rekke forskjellige moderne sekvenseringsteknologier | Sanger-sekvensering er en sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger for å bestemme nøyaktig nukleotidordre av et gitt DNA-fragment. |
| Kostnadseffektivitet | |
| NGS er en billigere prosess fordi det reduserer tid, mannekraft og kjemikalier. | Dette er en kostbar prosess fordi det tar tid, mannekraft og flere kjemikalier. |
| Hastighet | |
| Dette er raskere siden både kjemisk deteksjon og signaldeteksjon av mange tråder skjer parallelt. | Dette er tidkrevende siden kjemisk deteksjon og signal deteksjon skjer som to separate prosesser, og bare på streng kan lese om gangen. |
| Pålitelighet | |
| NGS er pålitelig. | Sanger-sekvensering er mindre pålitelig |
| Eksempelstørrelse | |
| NGS krever mindre mengde DNA. | Denne metoden trenger en stor mengde template DNA. |
| DNA-baser per sekvensfragment | |
| Antall DNA-baser per sekvensert fragment er lavere enn Sanger-metoden | Genereringssekvenser er lengre enn NGS-sekvenser. |
Sammendrag - NGS vs Sanger Sequencing
NGS og Sanger Sequencing er nukleotidsekvenseringsteknikker som er mye brukt i molekylærbiologi. Sanger-sekvensering er en tidlig sekvenseringsmetode som ble erstattet av NGS. Hovedforskjellen mellom NGS og Sanger Sequencing er at NGS er en høyhastighets, mer nøyaktig og kostnadseffektiv prosess enn Sanger-sekvensering. Begge teknikkene skapte store utbrudd i genetikk og bioteknologi.
Henvisning:
1. Nowrousian, Minou. "Next Generation Sequencing Techniques for Eukaryotic Microorganisms: Sequencing-Based Solutions to Biological Problems." Eukaryotic Cell. American Society for Microbiology, september 2010. Web. 18. februar 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen, og A. R. Coulson. "DNA-sekvensering med kjede-terminerende inhibitorer." Proceedings of the National Academy of Sciences 74.12 (1977): 5463-467. web.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu og Maggie Law. "Sammenligning av neste generasjons sekvenseringssystemer." Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. web.
Bilde Courtesy:
"Sanger-sequencing" Av Estevezj - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
"Utviklingen i neste generasjons sekvensering" Av Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia
