Hvorfor er 16 rRNA brukt til å identifisere bakterier

Bakterier er den mest allestedsnærværende livsformen på jorden. Biomassen til bakterier overgår det til planter eller dyr. På grunn av deres overflod har de fleste bakteriearter hittil ikke blitt identifisert. Den tradisjonelle identifikasjonen av bakterier er basert på fenotypiske egenskaper, som ikke er nøyaktige som genotypiske metoder. Sammenligningen av 16S rRNA-sekvensen har oppstått som en mest foretrukket genotypisk metode for identifisering av bakterier i slektsnivå. Det er flere grunner til å bruke 16S rRNA som en housekeeping genetisk maker, som vil bli forklart nærmere i detalj.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er 16S rRNA
     - Definisjon, struktur, rolle
2. Hvorfor er 16S rRNA brukt til å identifisere bakterier
     - Innledning, grunner, metoder
3. Hva er applikasjonene til 16S rRNA i mikrobiologi
     - applikasjoner

Nøkkelbetingelser: Bakterier, Klassifisering, Gensekvens, Identifikasjon, Ribosom, 16S rRNA

Hva er 16S rRNA

16S rRNA er en komponent av den lille underenheten til det prokaryote ribosomet. De to underenhetene til det prokaryote ribosomet er 50S stor underenhet og 30S liten underenhet. De danner 70S ribosom. Den lille underenheten er sammensatt av 16S rRNA bundet til 21 proteiner. 16S rRNA består av 1540 nukleotider. Den sekundære strukturen av 16S rRNA er vist i Figur 1.

Figur 1: 16S rRNA

3'end av 16S rRNA inneholder anti-Shine-Dalgarno-sekvensen som binder oppstrøms til startkodonet, AUG. Shine-Dalgarno-sekvensen er det ribosomale bindingsstedet til bakteriell mRNA. Siden 16S rRNA er avgjørende for bakteriens funksjon, er genet som koder for 16S rRNA høyt konsentrert blant bakteriearter. Sekvensen av 16S rRNA er mye brukt i identifisering og klassifisering av bakterier. 

Hvorfor er 16S rRNA brukt til å identifisere bakterier

De tradisjonelle identifikasjonsmetoder for bakterier er hovedsakelig basert på fenotypiske egenskaper hos bakterier. Sammenligningen av 16S rRNA-sekvensen er imidlertid blitt en "gullstandard", som erstatter de tradisjonelle metodene for bakteriell identifikasjon. Analysen av 16S rRNA-sekvensen er bedre for identifisering av fenotypisk avvikende, dårlig beskrevne eller sjelden isolerte stammer. Det er også bedre for identifisering av ikke-dyrkede bakterier og nye patogener. 16S rRNA-genet forekommer i rRNA-operonen i bakteriegenomet. RRNA operon er vist i figur 2.

Figur 2: rRNA Operon

16S rRNA er egnet til å brukes som en husholdningsgenetisk markør på grunn av flere grunner. De er beskrevet nedenfor.

1. 16S rRNA-genet er et ubiquitøst gen i bakteriegenomet. Siden 16S rRNA-funksjonen er viktig for bakteriecellen under oversettelse, er nesten alle bakteriegenene sammensatt av 16S rRNA-genet.
2. Sekvensen av 16S rRNA-genet er sterkt konservert. Som funksjonen av 16S rRNA er mer generell, er sekvensen av 16S rRNA genet sterkt konservert. Endringene i gensekvensen kan betraktes som en måling av tid (evolusjon).
3. Størrelsen på 16S rRNA genet (1, 550 bp) er tilstrekkelig for bioinformatikk formål.
4. 16S rRNA-genet er et godt studert gen i bakteriegenomet. Siden funksjonen til 16S rRNA genet er viktig for cellen, blir den utsatt for mange studier.

Identifikasjon

Oppdatert er over 8, 168 bakteriearter identifisert ved bruk av 16S rRNA-gensekvens. Prosedyren for identifikasjonsprosessen er beskrevet nedenfor.

1. Ekstraksjon av genomisk DNA
2. PCR-amplifisering av 16S rRNA-genet
3. Oppnå nukleotidsekvensen av det amplifiserte 16S rRNA-genet
4. Sammenlign sekvensen med eksisterende nukleotidsekvenser i databasene

16S rRNA sekvensen er ca. 1, 550 basepar lang og består av både variable og konserverte regioner. De universelle primere, som er komplementære til det konserverte område av genet, kan brukes til amplifisering av den variable region av genet ved PCR. Generelt blir 540 baseparregionen fra begynnelsen av genet eller hele genet forsterket ved PCR. PCR-fragmentet sekvenseres, og sekvensen sammenlignes med de eksisterende nukleotidsekvenser av 16S rRNA-genet for identifisering av de forhånds-isolerte bakterieartene. GenBank, det største lagringsstedet for nukleotidsekvenser, har over 20 millioner sekvenser på 90.000 forskjellige 16S rRNA-gener. Hvis bakterieartene er nye, vil ikke sekvensen samsvare med noen 16S rRNA-sekvens i databasene.

Klassifisering

Siden 16S rRNA-gensekvensen er funnet i nesten alle bakteriearter, kan sammenligningen av forskjellige 16S rRNA-gensekvenser brukes til å skille bakterier opp til arter og underarter. Lignende bakteriearter kan ha lignende sekvenser av 16S rRNA-genet. Et fylogenetisk tre av bakterier konstruert ved å sammenligne 16S rRNA-gensekvensen er vist i figur 3.

Figur 3: Phylogenetisk Tre Konstruert Basert på 16S rRNA Sequence Sammenligning

Hva er applikasjonene av 16S rRNA i mikrobiologi

Anvendelsene til 16S rRNA i mikrobiologi er oppført nedenfor.

1. 16S rRNA gen sekvensering brukes som "gullstandard" for identifisering og taksonomisk klassifisering av bakteriearter.
2. Sammenligning av 16S rRNA-sekvensen kan brukes for å gjenkjenne nye patogener.
3. 16S rRNA sekvensering kan brukes som et raskt og billig alternativ til fenotypiske metoder for bakteriell identifikasjon i medisinsk mikrobiologi.

Konklusjon

16S rRNA er avgjørende for bakteriens funksjon, da det gir et sted for binding av bakteriell mRNA til ribosomet under oversettelse. Siden funksjonen til 16SrRNA er avgjørende for cellen, er gensekvensen sin i nesten alle bakterieceller. Dessuten er dens rekkefølge sterkt konservert. Imidlertid er 16S-rRNA-sekvensen også sammensatt av variable regioner som tillater identifisering av bakteriearter. I tillegg kan bakteriearter klassifiseres basert på gensekvensen av 16S rRNA.

Henvisning:

1. Janda, J. Michael, og Sharon L. Abbott. "16S rRNA-gensekvensering for bakteriell identifikasjon i diagnostisk laboratorium: plusser, farer og fallgruver." Journal of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, september 2007, tilgjengelig her.
2. Clarridge, Jill E. "Virkning av 16S rRNA-gensekvensanalyse for identifisering av bakterier på klinisk mikrobiologi og smittsomme sykdommer." Klinisk mikrobiologi vurderinger, American Society for Microbiology, okt. 2004, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "16S" Av Squidonius - Eget arbeid (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Amit Yadav Phytoplasma rRNA operon" (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "Phylogenetisk posisjon av Mollicutes blant bakterier" Av Kenro Oshima, Kensaku Maejima og Shigetou Namba - Front. Microbiol., 14. august 2013 / doi: 10.3389 / fmicb.2013.00230 (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia