Differkinome

Hva er forskjellen mellom direkte og indirekte ELISA

Vitenskap
Share

De hovedforskjell mellom direkte og indirekte ELISA er det i direkte ELISA blir det primære antistoff direkte konjugert til deteksjonsenzymet, mens i sekundært ELISA er et sekundært antistoff som er komplementært til det primære antistoffet konjugert med deteksjonsenzymet. Dette betyr at direkte ELISA bruker et enkelt antistoff mens indirekte ELISA bruker to antistoffer.

Direkte og indirekte ELISA er to metoder for ELISA (enzymbundet immunosorbant assay) som brukes til å detektere nærvær av et spesifikt antigen eller antistoff i mediet.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er direkte ELISA
     - Definisjon, Prosedyre, Egenskaper
2. Hva er Indirekte ELISA
     - Definisjon, Prosedyre, Egenskaper
3. Hva er likhetene mellom direkte og indirekte ELISA
     - Oversikt over vanlige funksjoner
4. Hva er forskjellen mellom direkte og indirekte ELISA
     - Sammenligning av nøkkelforskjeller

Nøkkelord

Direkte ELISA, deteksjonsenzyme, indirekte ELISA, primært antistoff, sekundært antistoff, substrat

Hva er direkte ELISA

Direkte ELISA er en metode for ELISA som tillater deteksjon av antigenet med et enzymbundet primært antistoff selv. Denne ELISA-metoden ble først utviklet Perlmann og Engvall. Det regnes som den enkleste form for ELISA. Trinnene i direkte ELISA er oppført nedenfor:

  1. Coating overflaten av platen med prøven;
  2. Inkubasjon av platen med det enzym-konjugerte, primære antistoff;
  3. Vasking for fjerning av ubundne antistoffer fra platen;
  4. Tilsetning av substratet som kreves av den enzymatiske reaksjonen;
  5. Påvisning av signaler produsert fra platen.

Her er de to hovedtyper av enzymer som er konjugert med det primære antistoffet HRP (pepperrotperoksidase) og alkalisk fosfatase. De tre typer substrater som brukes sammen med HRP er OPD (o-fenylendiamin-dihydroklorid), TMB (3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin) og ABTS (2, 2'-azinobis [3-etylbenzotiazolin-6- sulfonsyre] -diammoniumsalt). Substratet som brukes sammen med alkalisk fosfatase er PNPP (p-nitrofenylfosfat, dinatriumsalt). Den enzymatiske reaksjonen på substratet forårsaker en fargeendring i mediet, som avhenger av typen av substrat og enzymet som anvendes for reaksjonen. Dette letter deteksjonen av prøver med målantigenet. 

Figur 1: Direkte ELISA

Direkte ELISA er mer egnet for påvisning av antigenen med høy molekylvekt i en prøve. Jo færre antall trinn i denne ELISA-metoden gjør det til en raskere analyse. På grunn av kostnaden og tiden innlemmet med merkingen av det primære antistoffet med enzymer, er imidlertid anvendelsen av direkte ELISA ganske sjelden. På den annen side gir det også bivirkninger på målantigenet.

Hva er Indirekte ELISA

Indirekte ELISA er en annen metode for ELISA som bruker to antistoffer for deteksjon: primært og sekundært antistoff. Trinnene i den indirekte ELISA er som følger:

  1. Coating overflaten av platen med prøven;
  2. Inkubasjon av platen med det primære antistoffet;
  3. Vask for å fjerne ubundne antistoffer fra platen;
  4. Inkubasjon av platen med det sekundære antistoffet konjugert med deteksjonsenzymet;
  5. Vask for å fjerne ubundne antistoffer fra platen;
  6. Tilsetning av substratet som kreves av den enzymatiske reaksjonen;
  7. Påvisning av signaler produsert fra platen.

    Figur 2: Indirekte ELISA

Indirekte ELISA går gjennom to antistoffbindende trinn. På den annen side er det sekundære antistoffet konjugert med deteksjonsenzymet. Generelt er det nok av sekundære antistoffer som er konjugert med enzymer. Her er det sekundære antistoffet hovedsakelig et polyklonalt antistoffantikropp. På grunn av tilgjengeligheten av enzymkonjugerte antistoffer, blir den indirekte ELISA-metoden oftere brukt i immunologiske analyser ved påvisning av parasitter, bakterier og virus. På den annen side kan flere sekundære antistoffer bindes til det primære antistoff i platen. Derfor er følsomheten av analysen meget høy.

Likheter mellom direkte og indirekte ELISA

  • Direkte og indirekte ELISA er to metoder for ELISA hvor antigenet av interesse er direkte festet til platen.
  • Begge metoder involverer i påvisning av tilstedeværelsen av et spesifikt proteinmolekyl i en prøve. Dette proteinmolekylet er direkte festet til platen.
  • 96-brønnplater eller 8-brønnstrimmelrør brukes i begge metoder. Begge disse platene og rørene består av polystyren. Platen med 96 brønner gir rikelig med mellomrom for bestemmelse av optimal fortynning for reaksjonen. I mellomtiden er 8-brønnstrimmelrør bedre for de finjusterte analysene.

Forskjellen mellom direkte og indirekte ELISA

Definisjon

Direkte Elisa refererer til en type ELISA hvor det primære antistoffet er konjugert med deteksjonsenzymet mens indirekte ELISA refererer til en type ELISA hvor det sekundære antistoffet er konjugert med deteksjonsenzymet.

Antall antistoffer brukt

Direkte ELISA bruker ett antistoff, som er det primære antistoffet mens indirekte ELISA bruker to antistoffer, primær og sekundært antistoff. Dette er hovedforskjellen mellom direkte og indirekte ELISA.

Deteksjonsenzymet er koblet til

Videre er deteksjonsenzymet koblet til det primære antistoffet i direkte ELISA mens deteksjonsenzymet er koblet til det sekundære antistoffet i indirekte ELISA.

Signalintensitet

En annen forskjell mellom direkte og indirekte ELISA er at signalene produsert av direkte ELISA er mindre intensive mens signalene produsert av indirekte ELISA er mer intensive på grunn av signalforsterkningen.

Bakgrunnssignaler

Imidlertid produserer direkte ELISA flere bakgrunnssignaler enn den indirekte ELISA.

Følsomhet

Direkte ELISA er mindre følsom mens indirekte ELISA er mer sensitiv. Dette er også en forskjell mellom direkte og indirekte ELISA. 

Kryssreaktivitet

Enda en annen forskjell mellom direkte og indirekte ELISA er kryssreaktiviteten. Det vil si at kryssreaktiviteten er minimum i direkte ELISA mens den er signifikant i indirekte ELISA.

Tid

Videre er direkte ELISA mindre tidskrevende på grunn av færre trinn mens indirekte ELISA er mer tidkrevende på grunn av de doblede antistoffbindende trinnene.

Hyppighet av bruk

Mens direkte ELISA er relativt sjeldent, er indirekte ELISA vanligere.

Konklusjon

Direkte ELISA bruker bare det primære antistoffet for påvisning av et spesifikt antigen. Dette betyr at det primære antistoffet er konjugert med deteksjonsenzymet i direkte ELISA. Imidlertid bruker indirekte ELISA et primært antistoff for å binde med antigenet mens det enzym-konjugerte sekundære antistoff binder til det primære antistoff. Direkte ELISA er mindre vanlig på grunn av den mindre tilgjengeligheten av enzym-konjugert primært antistoff. Hovedforskjellen mellom direkte og indirekte ELISA er antall antistoffer som brukes.

Henvisning:

1. "Typer ELISA." Bio-Rad, Bio-Rad Laboratories, tilgjengelig her

Bilde Courtesy:

1. "ELISA diagram" Av Cavitri - Eget arbeid (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia  
2. "Indirekte ELISA" Av Cawang - Eget arbeid (CC0) via Commons Wikimedia  

Vitenskap
×