Hvordan lage stabil transfektert cellelinje

Stabil transfeksjon er den langsiktige introduksjonen av fremmed DNA til celler. Stabilt transfekterte celler overfører det fremmede DNA gjennom avkom. Derfor, for å lage stabilt transfekterte cellelinjer, må fremmed DNA integreres i genomet av cellelinjen. Imidlertid kan stabil arv bli observert i nongenomisk DNA også. En vellykket, stabil transfeksjon krever effektive metoder for DNA-leveranse samt utvalgsmetoder for fremmed DNA innenfor cellelinjen. Stabilt transfekterte cellelinjer brukes til et bredt spekter av anvendelser, slik som produksjon av rekombinante proteiner, genfunksjonsstudier, analyser av narkotikaforskning, etc.

Nøkkelområder dekket

1. Hvordan lage stabil transfektert cellelinje
      - Stabil Cell Line Generation Protocol
2. Hvordan velge Transfected DNA i Cell Line
     - Utvalg av stabilt transfektert cellelinje

Nøkkelbetingelser: Episomal Vedlikehold, Integrasjon i Genomet, Plasmid, Utvalg, Stabil Transfected Cell Lines

Hvordan lage stabil transfektert cellelinje

Transfeksjon er en metode for genoverføring hvor det genetiske materialet bevisst innføres i vertscellen ved hjelp av kjemiske eller ikke-kjemiske metoder. Det finnes to typer stabilt transfekterte cellelinjer:

1. Den viktigste typen stabile cellelinjer genereres ved direkte integrasjon av transfektert DNA i genomet av vertsorganismen. Transfektert DNA er integrert i genomet ved homolog rekombination.
2. Den andre metoden for å generere stabile cellelinjer er episomal vedlikehold av det transfekterte DNA. Eukaryotiske vektorer brukes i transfeksjonen av DNA som ikke er integrert i genomet. Imidlertid er stabiliteten til episomal DNA lav. Også, episomer er bare vedlikeholdt av visse typer arter. Stabilt transfekterte cellelinjer er vist i Figur 1.

Figur 1: Stabil Transfected Cell Lines

Prosess

Trinnene involvert i genereringen av stabile cellelinjer er beskrevet nedenfor.

1. Generering av en killkurve som bestemmer det optimale utvalget antibiotikakonsentrasjon - Cellene blir utsatt for økende mengder antibiotikakonsentrasjon for å bestemme den minste antibiotikakonsentrasjon som kreves for å drepe alle celler over en uke.
2. Transfeksjon av celler med ønsket plasmidkonstruksjon - Metoden for transfeksjon er forskjellig med typen vertsceller. Liposomreagenser brukes i transfeksjonen av adherente cellelinjer. Elektrotransfeksjon eller virale metoder brukes til å transfektere suspensjoncellelinjer.
3. Velg og utvide stabile polyklonale kolonier - Ved 48-72 timer transfeksjon blir høye, optimale og lave konsentrasjoner av selektive antibiotika tilsatt til kulturer for å oppnå de stabilt transfekterte cellelinjer.

Hvordan velge transfektert DNA i cellelinjer

Seleksjonsmarkører blir co-uttrykt med det transfekterte DNA for seleksjon av vellykkede transfekterte celler. Markørgenet kunne være i samme vektor (cis) som ble brukt til å transfektere vertscellen eller på en annen vektor (trans). Motstanden mot antibiotika som neomycin, zeocin, hygromycin, puromycin, DHFR, etc. kan brukes i utvelgelsen. I tillegg kan transfekterte gener bli merket med GFP.

Konklusjon

Stabile cellelinjer kan hovedsakelig fremstilles ved å integrere transfektert DNA i genomet. Videre kan episomalt vedlikehold av transfektert DNA også bli anvendt til å lage stabile cellelinjer i lang tid i noen vertsorganismer. En utvelgelsesmetode bør være der for identifisering av transfektert DNA i cellelinjen. 

Henvisning:

1. "Protokoll for stabil cellelinjegenerering". Creative BioMart, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "Knockout museproduksjon 2" Av Kjaergaard - Eget arbeid (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia