Hvordan isolere mRNA fra Total RNA

Oligo-dT / bærerkombinasjonene anvendes hovedsakelig i rensingen av mRNA fra totalt RNA ved en teknikk kjent som affinitetskromatografi. Det er to hovedmetoder for å isolere mRNA fra totalt RNA basert på typen av celler; nemlig direkte metode for mRNA-isolasjon og minus-metode for mRNA-isolasjon. Begge metodene forklares i denne artikkelen.

Messenger RNA (mRNA) er et produkt av transkripsjon, som består av en rekke RNA-nukleotider. Den bærer informasjon i gener fra kjernen til cytoplasma for syntese av proteiner. RNA-isolasjon fra en bestemt cellelinje resulterer i totalt RNA, som består av rRNA og tRNA sammen med mRNA. Derfor bør mRNA separeres fra blandingen av totalt RNA under studiet av transkriptomet av cellelinjen. Unike egenskaper til mRNA, slik som tilstedeværelsen av en poly (A) hale ved 3'-enden av mRNA-molekylet, anvendes for separasjonen. Siden oligo-dT-molekyler er komplementære til poly (A) halen, kan mRNA isoleres fra en blanding av totalt RNA.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er mRNA
- Definisjon, struktur, funksjon
2. Hva er Sammensetningen av Total RNA
- mRNA, rRNA, tRNA
3. Hvordan isolere mRNA fra Total RNA
- Bruk av Oligo-dT / bærermolekyler

Nøkkelbetingelser: Affinitetskromatografi, Messenger RNA (mRNA), Minus Metode, Oligo dT, Poly (A) hale, Total RNA

Hva er mRNA

MRNA er et transkripsjon av et proteinkoding-gen. Den produseres inne i kjernen i eukaryoter og bærer informasjon for produksjon av et bestemt protein i cytoplasma. Det blir oversatt til en aminosyresekvens av proteinet under oversettelse, assistert av ribosomer. Det primære transkripsjon produsert ved transkripsjon av eukaryoter kalles pre-mRNA.

Figur 1: mRNA struktur

Under post-transkripsjon modifikasjoner produseres et modent mRNA-molekyl med flere funksjoner som 5'-deksel og poly (A) hale. Det totale mRNA av en bestemt organisme er kjent som dets transkriptom.

Hva er Sammensetningen av Total RNA

Resultatet av RNA-isolasjon kalles total RNA. Den består av alle tre hovedtyper av RNA produsert av en celle. De er mRNA, tRNA og rRNA. Både tRNA og rRNA hjelpemiddel i oversettelse. Størrelsen på eukaryot mRNA er 0,5-20 kb. Overførings-RNA (tRNA) bringer tilsvarende aminosyrer under oversettelse. Det er 76-90 basepar lange og består av antikodonregion, som er komplementær til et bestemt kodon på mRNA. Ribosomal RNA (rRNA) er en komponent av ribosomer. Noen av de menneskelige rRNA er 5 kb lange.

Over 90% av det totale RNA er sammensatt av tRNA og rRNA. Bare 1-5% av totalt RNA er mRNA. En typisk pattedyrcelle kan bestå av ca. 500.000 mRNA molekyler per celle. Mengden av en bestemt type mRNA kan være 15-20.000 eksemplarer per celle.

Hvordan isolere mRNA fra Total RNA

En rekke molekylærbiologiteknikker som cDNA-bibliotekskonstruksjon, prøvepreparering for mikroarraypreparasjon, Northern blot-analyse for svakt uttrykte gener, etc. krever høy kvalitet mRNA. Det er to hovedmetoder for å isolere mRNA fra totalt RNA basert på typen av celler: direkte metode for mRNA-isolasjon og minus-metode for mRNA-isolasjon.

Direkte metode for mRNA-isolasjon

Prinsippet for separasjon av modent mRNA fra eukaryotisk totalt RNA involverer affinitetsseleksjon / affinitetskromatografi av polyadenylert mRNA ved bruk av oligo dT (oligodeoksymidylat), som er komplementært til poly (A) halen. Det er muliggjort ved fravær av en poly (A) hale i de to andre typer RNA: tRNA og rRNA.

mRNA består av 30-200 adenin nukleotider i sin poly (A) hale. Affinitetskolonner fylt med oligo dT / bærerkombinasjon brukes i isoleringen av mRNA fra totalt RNA. Oligo dT / bærerkombinasjonen kan enten være cellulosebundet oligo dT, biotinylert oligo dT med streptavidinkoblede magnetiske perler eller oligo dT-koplede polystyren-latexperler. Alle eksperimentelle forhold bør være i RNase-fri tilstand for å forhindre enzymatisk nedbrytning av RNA.

Figur 2: Affinitetskromatografi

Totalt RNA bør oppløses i en høy saltbuffer og oppvarmes kort til 65-70 ° C for å forstyrre sekundære strukturer av RNA. Betingelsene for isolering av RNA varierer blant kommersielt tilgjengelige kits for mRNA-isolasjon. Imidlertid er fremstilling av poly (A) -RNA eller mRNA sammensatt av tre trinn.

Hybridisering av poly (A) -RNA til oligo dT-molekyler koblet til en bærer
Vasking av ubundet RNA
Eluering av poly (A) -RNA fra oligo-dT / bærerkombinasjon under lave stringensbetingelser

Minus Metode for mRNA-isolering

Oligo dT-basert rensing av mRNA gir bare mRNA med en poly (A) hale eller modent eukaryotisk mRNA. Derfor kan en annen metode kjent som minusmetode brukes i rensingen av mRNA som ikke har en poly (A) hale. Denne metoden kan brukes i isolering av mRNA fra gjær og bakteriell total RNA. Det kan også brukes i isolering av umodne typer mRNA sammen med det modne mRNA fra eukaryotiske celler. Det involverer transkriptomberigelsen ved å depletere stort ribosomalt RNA fra totalt RNA. The RiboMinus^TM Transcriptome Isolation kit fra ThermoFisher Scientific bruker tre trinn i effektiv rensing av mRNA fra gjær og bakteriell total RNA.

Hybridisering av totalt RNA med rRNA-sekvens-spesifikke, 5'-biotin-merkede oligonukleotidprober
Fjernelse av rRNA / 5'-biotin-merket probekompleks sammen med streptavidin-belagte magnetiske perler
Rensing av urenheter og eluering av mRNA.

Konklusjon

Totalt RNA er sammensatt av de tre hovedtyper av RNA: mRNA, rRNA og tRNA. Rensing av mRNA fra totalt RNA er essensielt for analysen av transkriptomet til en bestemt organisme. Metodene for rensing er basert på typen av mRNA. Eukaryotisk mRNA, som inneholder en poly (A) hale, kan isoleres ved affinitetskromatografi med oligo dT. Ufruktet eukaryotisk mRNA og mRNA fra gjær og bakterieceller kan isoleres ved å tømme stort rRNA fra totalt RNA.

Henvisning:

1. "mRNA Extraction." Thermo Fisher Scientific, tilgjengelig her.
2. "RNA-ekstraksjon med RNA Type." Thermo Fisher Scientific, tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "Eldre mRNA" (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Affinity" av Jamit på engelsk - Overført fra en.wikibooks til Commons av Adrignola ved hjelp av CommonsHelper (Public Domain) via Commons Wikimedia

Vitenskap