Hvordan virker Western Blotting?

Western blotting er en teknikk i molekylærbiologi som brukes i påvisning av et spesifikt protein i en prøve. Den bruker SDS-PAGE til å separere proteiner basert på deres størrelse, og disse separerte proteinene overføres deretter til en membran. Denne teknikken bruker spesifikke primære antistoffer i merkingen av et bestemt protein i blottet. Sekundære antistoffer som er merket med reporterproteiner, oppdager de labled-proteiner med det primære antistoff.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er Western Blotting
     - Definisjon, fakta, applikasjoner
2. Hvordan virker Western Blotting?
     - Prosess av Western Blotting

Nøkkelbetingelser: Fargeutvikling, Nitrocellulose Membran, Primærantistof, Sekundært Antistoff, Western Blotting

Hva er Western Blotting

Western blotting er en hybridiseringsteknikk som brukes i påvisning av et bestemt protein i en prøve. Det kalles også immunoblotting siden teknikken bruker antistoffer for både å merke proteinet av interesse og deteksjon av antistoffmerkede proteiner.

Figur 1: Western Blot

Western blotting ble først utviklet av Towbin i 1979, og det brukes for tiden som en rutinemetode for proteinanalyse. 

Hvordan virker Western Blotting?

Western blotting brukes hovedsakelig ved påvisning av et spesifikt protein i en prøve. Trinnene i Western blotting teknikken er beskrevet nedenfor.

1. SDS-PAGE - Proteinprøven separeres basert på deres størrelse ved SDS-PAGE.
2. Overføring av proteiner til en membran - De størrelsesfraksjonerte proteiner overføres til enten en nitrocellulose- eller polyvinyliden-difluorid-membran (PVDF). Teknikkene som er involvert i denne overføringen er diffusjonsoverføring.
3. Blokkerer ikke-spesifikke nettsteder - De ubesatte steder på membranen er blokkert for å forhindre ikke-spesifikk binding av proteiner. Nonfat tørr melk eller Bovine serum albumin (BSA) kan brukes til dette formålet.
4. Primær antistoff inkubasjon - Den blokkerte membranen inkuberes med en primær antistoffløsning. Disse primære antistoffene binder seg til et bestemt protein på membranen.
5. Sekundær antistoff inkubasjon - Membranen inkuberes med sekundære antistoffer, som binder til de primære antistoffene. Sekundære antistoffer er konjugert til reporterproteiner. Disse reporterproteinene kan være biotin, alkalisk fosfatase eller pepperrotperoksidase.
6. Proteindeteksjon ved fargeutvikling - De konjugerte enzymet reportere reagerer med deres substrat for å generere en farget alkalisk fosfatase omdanner BCIP til et blått fargeprodukt mens pepperrotperoxidase konverterer luminol, emitterende luminesce.

Figur 2: Western Blotting - Prosedyre

Konklusjon

Western blotting er en hybridiseringsteknikk som brukes i påvisning av tilstedeværelsen av et bestemt protein i en prøve. Den bruker SDS-PAGE til å separere proteiner basert på deres størrelse og binding med primære antistoffer, som kan gjenkjennes av sekundære antistoffer under fargeutvikling.

Henvisning:

1. "Western Blotting Fundamental Princip, How Western Blots Work." BOOSTER, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "Anti-lipoic acid immunoblot" Av TimVickers - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Western Blotting" Av Cawang - Eget arbeid, CC0) via Commons Wikimedia