Hvordan fungerer Southern Blotting

Southern blotting er en teknikk som brukes til påvisning av spesifikt DNA-fragment i en prøve. Blottingsteknikken innebærer separering av DNA-fragmenter basert på størrelse via gelelektroforese, overføring av størrelsesfraksjonert DNA-prøve på en filtermembran, hybridisering av de spesifikke DNA-fragmenter med en merket sekvensspesifikk probe og detektering av de merkede båndene.

I tillegg til identifisering av spesifikt DNA i en prøve, kan størrelsen og overflaten av en bestemt type DNA også bestemmes ved Southern blotting. Prosessen involvert i Southern blotting er beskrevet i denne artikkelen.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er Southern Blotting
     - Definisjon, prinsipp, applikasjoner
2. Hvordan fungerer Southern Blotting
     - Prosess av Southern Blotting

Nøkkelbetingelser: DNA, Gelelektroforese, Hybridiseringsprobe, Nylonmembran, Restriksjonsfordøyelse, Southern Blotting

Hva er Southern Blotting

Southern blotting er en hybridiseringsteknikk som brukes ved identifisering av spesifikt DNA i en prøve. Teknikken ble først utviklet av Edward M. Southern i 1975. Denne prosessen identifiserer DNA-sekvenser, størrelse og overflod av en bestemt DNA-sekvens i en prøve.

En Southern blotting membran er vist i Figur 1.

Figur 1: Southern Blotting Membrane

Søknader av Southern Blotting

Anvendelser av Southern blotting er beskrevet nedenfor.

  1. Å oppdage et bestemt DNA-fragment
  2. Å isolere et bestemt DNA-fragment
  3. Å identifisere mutasjoner og genarrangementer
  4. I RFLP-analyser (restriksjon fragment lengde polymorfisme)
  5. Å identifisere genetiske sykdommer
  6. Å identifisere smittsomme stoffer
  7. Faderskapstesting
  8. I DNA fingeravtrykk for å identifisere kriminelle

Hvordan fungerer Southern Blotting

Southern blotting involverer separering av DNA-fragmenter basert på størrelse via gelelektroforese, overføring av dem til en membran, hybridisering av dem med en merket sekvensspesifikk probe og detektering av de merkede båndene. Trinnene i Southern blotting er beskrevet nedenfor.

  1. DNA-fordøyelse - DNA-prøven spaltes av restriksjonsenzymer for å oppnå DNA-fragmenter, og disse fragmentene blir amplifisert ved PCR.
  2. Gelelektroforese - DNA-fragmenter er størrelsesfraksjonert ved gelelektroforese.
  3. denaturering - Gelen med fraksjonert DNA blir gjennomvåt i NaOH eller HC1 for å denaturere dobbeltstrenget DNA.
  4. blotting - DNA-fragmenter i gelen overføres til en positivt ladet nylonmembran ved en prosess som kalles blotting.
  5. Baking og blokkering - Blottpapiret med DNA-fragmenter blir bakt for å fikse DNA på membranen. Deretter er de ubebodde bindingsstedene mettet ved behandling med bovint serumalbumin (BSA) eller kasein.
  6. Hybridisering med merkede prober - DNA-bundet membran behandles med en merket probe som inneholder komplementær nukleotidsekvens til det interesserte DNA-fragment. Hybridiseringsprober er generelt 100-500 bp lange, og de er merket med radioaktive nukleotider.
  7. Visualisering ved autoradiogram - Den probebundne membran visualiseres under autoradiogram for å oppnå mønstrene av det interesserte DNA-fragment.

Figur 2: Southern Blotting

Hele prosessen med Southern blotting er vist i figur 2.

Konklusjon

Southern blotting er en hybridiseringsteknikk som brukes i identifiseringen av spesifikke DNA-sekvenser fra en prøve. I denne prosessen fraksjoneres DNA-prøven av restriksjonsenzymer, og blandingen drives på en gel. Deretter overføres båndmønsteret i gelen til en nylonmembran og hybridiseres med en merket probe som tillater deteksjon av det interesserte fragmentet.

Henvisning:

1. "Southern Blotting." Thermo Fisher Scientific, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "Southern blot membran" Av Bojan Žunar - Eget arbeid (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Figur 17 01 05" Av CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia