Hvordan virker DNA-sekvensering?

Sekvensering er prosessen involvert i bestemmelsen av en nukleotidsekvens av et bestemt DNA-fragment. Under sekvensering merkes DNA-fragmentet terminalt med fluorescensmerkede nukleotider ved PCR. Denne prosessen bruker fire typer fluorescensmerkede nukleotider, og de er dideoxynukleotider (ddNTPer). ddNTPs mangler en 3'-OH-gruppe til hvilken fosfatgruppen av det innkommende nukleotid er festet. Når en ddNTP blir tilsatt til vekstkjeden, vil det derfor ikke bli ytterligere tillegg av nukleotider ved 3'-enden av kjeden. Det betyr at tilskudd av ddNTP i vekstkjeden stopper kjedeveksten. Siden ddNTPs legges til PCR-blandingen i lave konsentrasjoner, avsluttes hver voksekjede på forskjellige nivåer. Den emitterende fluorescens detekteres for å bestemme nukleotidsekvensen av DNA-fragmentet på slutten av PCR.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er DNA-sekvensering
     - Definisjon, Typer
2. Hvordan virker DNA-sekvensering?
     - Prosess av DNA-sekvensering

Nøkkelbetingelser: Dideoxynukleotider (ddNTPer), Fluorescerende Markør, Gelelektroforese, Neste Generasjons Sequencing, Nukleotidsekvens, PCR, Sanger Sequencing

Hva er DNA-sekvensering 

DNA-sekvensering er en laboratorieteknikk som brukes i bestemmelsen av nukleotidsekvensen av et bestemt DNA-molekyl. Den bruker fluorescens-merkede nukleotider, som er inkorporert under PCR. Det er to hovedmetoder for sekvensering basert på teknikkene som brukes i påvisning av fluorescens: Sanger-sekvensering og neste generasjons sekvensering.

Sanger-sekvensering

Sanger-sekvensering, utviklet av Fredric Sanger i 1975, er den første utviklede sekvenseringsmetoden. Det er også kjent som kjede-terminering metode siden Det er involvert i selektiv inkorporering av kjedeavslutende ddNTPs under in vitro DNA syntese. I Sanger-sekvensering separeres amplikoner ved gelelektroforese. Sanger-sekvensering er mye brukt for bestemmelse av sekvensen av DNA-fragmentene som anvendes ved kloning og fragmentene amplifisert ved PCR. En bestemt DNA-sekvens er vist i Figur 1.

Figur 1: DNA-sekvensering

Next-Generation Sequencing

Nyeste DNA-sekvenseringsteknologier er kollektivt kjent som neste generasjons sekvensering. Det er også en kjedeavslutningsmetode. Neste generasjons sekvensering bruker kapillærelektroforese for separering av amplikoner med forskjellige lengder opprettet ved kjedeavslutningsmetode. Neste generasjons sekvensering brukes i bestemmelsen av et stort antall nukleotider per løpet, som i genom-sekvensering.

Hvordan virker DNA-sekvensering?

Under DNA-sekvensering blir fluorescensmerkede nukleotider tilsatt til et bestemt DNA-fragment ved PCR. For forlengelse av DNA-strengen benyttes vanlige deoksynukleotider (dNTP'er). Imidlertid blir ddNTPer tilsatt til reaksjonsblandingen, som er fluorescens-merket. Siden ddNTP ikke har en 3'-OH-gruppe i deoxyribosesockermolekylet, kan det ikke oppstå ytterligere kjedevekst, og avslutter kjedeveksten. Sukkerfosfat-ryggrad av DNA dannes ved dannelse av fosfodiesterbindinger mellom 3'-OH-gruppen i deoksyriboser-sukker- og fosfatgruppen av det innkommende nukleotid. Imidlertid blir ddNTPs tilsatt i lave konsentrasjoner; derfor avslutter de ikke kjedeveksten på en gang.

Fire typer ddNTPs blir tilsatt til fire separate PCR-blandinger. Fire separate PCR-reaksjoner utføres ved å tilsette ddATP, ddGTP, ddCTP og ddTTP. Derfor, i hver reaksjonsblanding, avsluttes kjedevæksten ved henholdsvis A, G, C og T-nukleotider. Som et eksempel, i reaksjonsblandingen med tilsatt ddATP, termineres veksten av forskjellige amplikoner ved hvert A-nukleotid i DNA-fragmentet. Bestemmelse av DNA-sekvens ved Sanger-sekvensering er vist i figur 2.

Figur 2: Sanger-sekvensering

Hver av de fire typer nukleotider er merket med separat fluorescensfarge; de ddATP er merket med grønt fargestoff; de ddGTP er merket med gult fargestoff; de ddCTP er merket med blå; de ddTTP er merket med rødt fargestoff. Derfor er amplikonene til de fire PCR-reaksjonene merket i separate farger.

Etter amplifikasjonen av det interesserte DNA-fragment separeres amplikonene enten ved gelelektroforese eller kapillærelektroforese. Nukleotidsekvensen av DNA-fragmentet kan bestemmes ved påvisning av den emitterende fluorescens. Nukleotidsekvensen på 750-1000 basepar lange fragmenter kan enkelt bestemmes per løpet av Sanger-sekvensering. Imidlertid forblir bestemmelsen av nukleotidsekvensen av et helt genom utfordrende på grunn av et stort antall nukleotider i genomene. Imidlertid kan neste generasjons sekvenseringsteknikker som 454 sekvensering, leses rundt 20 millioner basepar per enkelt løp.

Konklusjon

DNA-sekvensering er en molekylærbiologiteknikk som brukes i bestemmelsen av nukleotidsekvensen av DNA-fragmenter. Under sekvensering blir fluorescensmerkede nukleotider tilsatt DNA-fragmentene ved PCR. Ved å detektere emitterende fluorescens kan nukleotidsekvensen bestemmes.

Henvisning:

1. "DNA-sekvensering". Khan Academy, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "DNA-sekvens" Av Sjef - eget arbeid, offentlig domene) via Commons Wikimedia
2. "Didesoxy-Metode" Av Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, som er grunnlegger av Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia