Hvordan hjelper fluorescerende markører å bestemme en nukleotidsekvens

DNA-sekvensering er en teknikk som bidrar til å bestemme nukleotidsekvensen til et bestemt DNA-molekyl. De to metodene for sekvensering er Sanger-sekvensering og neste generasjons sekvensering. Begge typer sekvenseringsmetoder er fullt automatiserte oppdatert. En hvilken som helst DNA-streng består av de fire nukleotidene: adenin (A), guanin (G), cytosin (C) og tymin (T). Nukleotidene i DNA-fragmentet er merket med fire separate fluorescerende markører i begge typer sekvenseringsmetoder. De fluorescerende markørene eller fluoroforene er molekyler som er i stand til å absorbere lys og utstråle det ved en veldefinert bølgelengde. De fluorescerende markørene inkorporeres i DNA-strengen ved PCR. Så bestemmes sekvensen av nukleotidene ved hjelp av automatiserte teknikker.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er sekvensering
     - Definisjon, Sanger Sequencing, Next Generation Sequencing
2. Hvordan hjelper fluorescerende markører å bestemme en nukleotidsekvens
     - Sekvenseringsprosedyre

Nøkkelbetingelser: Dideoxynukleotider (ddNTPer), Fluorescerende Markør, Gelelektroforese, Neste Generasjons Sequencing, Nukleotidsekvens, PCR, Sanger Sequencing

Hva er sekvensering

Sekvensering er en laboratorieteknikk som brukes til å bestemme nukleotidsekvensen til et DNA-molekyl. To hovedtyper av DNA-sekvenseringsmetoder kan identifiseres som Sanger-sekvensering og neste generasjons sekvensering. Både Sanger-sekvensering og neste generasjons sekvensering bruker merkede nukleotider med fluorescens for bestemmelse av nukleotidsekvensen.

Sanger-sekvensering

Sanger-sekvensering er den første utviklede metoden for DNA-sekvensering. Metoden for sekvensering ble først utviklet av Fredric Sanger i 1975. Følgelig er den kjent som Sanger-sekvensering. Metoden for Sanger-sekvensering er også kjent som kjede-terminering metode som det er involvert i selektiv inkorporering av kjede-terminerende dideoxynukleotider (ddNTPS) ved DNA-polymerase under in vitro DNA syntese. Forlengelsen av DNA-strengen oppnås ved de vanlige deoksynukleotidene (dNTPs). Imidlertid blir ddNTPer tilsatt til reaksjonsblandingen for å avslutte kjedeveksten. Disse ddNTPene er fluorescerende merket. De fire typer ddNTPs blir tilsatt til fire separate PCR-blandinger. Derfor utføres fire separate PCR-reaksjoner ved å tilsette ddATP, ddGTP, ddCTP og ddTTP. I hver reaksjonsblanding avsluttes kjedeveksten ved henholdsvis henholdsvis A, G, C og T-nukleotider. Som et eksempel, i reaksjonsblandingen med tilsatt ddATP, termineres veksten av forskjellige amplikoner ved hvert A-nukleotid i DNA-fragmentet. Deretter separeres disse fire reaksjonene ved gelelektroforese, og et fluorometer brukes til å skanne for den separate fluorescens. Sanger-sekvensering er mye brukt for bestemmelse av sekvensen av fragmentene som brukes i DNA-kloning og fragmentene amplifisert ved PCR. De bestemte nukleotidsekvensene er vist i Figur 1.

Figur 1: DNA-sekvenser

Next-Generation Sequencing

De nyeste DNA-sekvenseringsteknologiene er kollektivt kjent som neste generasjons sekvensering. Sekvenseringsreaksjonene utføres i mikroskop på en brikke på en gang. Derfor utføres flere sekvenseringsreaksjoner parallelt. I neste generasjons sekvensering brukes kapillærelektroforese i tillegg til gelelektroforese for separering av amliotoner med forskjellige lengder opprettet ved kjedeavslutningsmetode. Kapillærelektroforese er en analytisk separasjonsmetode hvor molekylene separeres basert på deres elektroforetiske mobilitet.

Hvordan hjelper fluorescerende maskiner å bestemme en nukleotidsekvens

Under sekvensering tjener DNA som skal sekvenseres som templatstreng for DNA-syntese ved PCR. En DNA-primer brukes for initiering av DNA-syntese ved DNA-polymerase. En blanding av faste, fire baser (dNTPs, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) og et lavt nivå av en av de fire dideoxynukleotidene (ddNTPs, ddATP, ddGTP, ddCTP og ddTTP) blir tilsatt som komponenter i PCR-reaksjonen. Derfor utføres fire individuelle PCR-reaksjoner ved tilsetning av hver av de fire ddNTPs. Dideoxynukleotider har to spesielle egenskaper:

1. De mangler 3'-OH-gruppe som det innkommende nukleotid tilsettes av DNA-polymerase. Derfor slutter inkorporeringen av ddNTP kjedeveksten.
2. De er merket med forskjellige fluorescerende fargestoffer: ddATP er merket med et grønt fargestoff, de ddGTP er merket med et gul fargestoff, de ddCTP er merket med blå, og ddTTP er merket med rødt fargestoff.

Kjedets avslutende ddNTPs blir imidlertid tilsatt i lave konsentrasjoner; de avslutter ikke hele PCR-prosessen samtidig. Men når en av de fire ddNTPene er innlemmet i vekstkjeden, avsluttes denne kjedeveksten. Derfor, ved slutten av hver fire PCR-reaksjoner, produseres en serie amplikoner (de resulterende DNA-fragmentene ved PCR), som termineres ved hvert nukleotid av mål-DNA-fragmentet. Disse amplikonene kan kjøres i en gel. De fluorescerende fargestoffer som passerer ved et definert punkt av den elektroforetiske gel kan skannes av et fluorometer for å bestemme nukleotidsekvensen i de automatiserte DNA-sekvenser. Den fluorescerende merkede nukleotidsekvensen oppnådd i DNA-sekvensering er vist i figur 2.

Figur 2: Fluorescerende merket nukleotidsekvens

Ved å kombinere hver av nukleotidene i serien, kan nukleotidsekvensen av det initiale DNA-fragmentet bestemmes. Nukleotidsekvensen av et fragment med 750-1000 basepar kan enkelt bestemmes per løpet av Sanger-sekvensering. Imidlertid er sekvenseringen av et helt genom fortsatt utfordrende på grunn av tilstedeværelsen av et stort antall nukleotider. 454 sekvensering er en type neste generasjons sekvensering hvorav 20 millioner basepar kan leses per enkelt løp.

Konklusjon

Sekvensering er en teknikk som brukes i bestemmelsen av nukleotidsekvensen av et bestemt DNA-fragment. Sanger-sekvensering og neste generasjons sekvensering er de to viktigste sekvenseringsteknologiene. Begge teknologiene bruker fluorescerende markører til bestemmelse av nukleotidsekvensen. Hver av de fire kjede-terminerende dideoxynukleotidene er merket med fire forskjellige fluorescerende fargestoffer, og de brukes i fire separate PCR-reaksjoner for å oppnå sekvensen.

Henvisning:

1. Adams, Jill U. "DNA Sequencing Technologies." Nature News, Nature Publishing Group, tilgjengelig her.
2. Carr, Steven M. Fluorescerende sekvensering, Tilgjengelig her.
3. "Sequencing DNA - Automatisert sekvensering med fluorescerende fargestoffer." JRank artikler, tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "Alineando secuencias (2)" av Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) via Flickr
2. "Radioactive Fluorescent Seq" Av Abizar på engelsk Wikipedia (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia