Hvordan brukes restriksjonsenzymer til å lage rekombinant DNA

Rekombinant DNA er en kunstig type DNA produsert ved å kombinere DNA av to eller flere arter. Prosessen med å lage rekombinant DNA er kjent som molekylær kloning. Den grunnleggende prosedyre for molekylær kloning inkluderer isolering av DNA, kutting av DNA, sammenføyning av DNA og amplifisering av det rekombinante DNA. Genet av interesse er satt inn i vektoren, som tjener som bærermolekylet for genet av interesse. Vektoren, sammen med genet av interesse, refereres til det rekombinante DNA. Hovedrolle av restriktjonsenzymer i genkloning er kutting av DNA. Nøkkelfunksjonen til restriksjonsenzymer som gjør dem egnede til DNA-manipulasjon, er at de kutter DNA ved bestemte mål. Dette tillater fremstilling av ønskede DNA-fragmenter for sammenføyningsformålet.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er begrensningsenzymer
     - Definisjon, Egenskaper, rolle
2. Hvordan brukes restriksjonsenzymer til å lage rekombinant DNA
     - Gene Cloning, Bruk av Restriksjon Enzymer i Gene Cloning

Nøkkelbetingelser: Kutting av DNA, genkloning, gen av interesse, molekylær kloning, rekombinant DNA-teknologi, begrensningsenzymer, vektor

Hva er begrensningsenzymer

Et restriksjonsenzym er en endonuklease som gjenkjenner korte, spesifikke DNA-sekvenser kjent som restriksjonssteder og spalter DNAet på det stedet. De er en type biokjemisk saks produsert av bakterier. Begrensningsenzymer forsvarer bakterier fra bakteriofager. Disse enzymene er isolert fra bakterier og brukes til å kutte DNA i laboratoriet. Virkningen av et restriksjonsenzym er vist i Figur 1.

Figur 1: HindIII-handling

Evnen til restriksjonsenzymer til å kutte DNA på presise steder tillater forskere å isolere genholdige fragmenter fra genomisk DNA. Disse fragmentene kan settes inn i vektorer for å produsere rekombinante DNA-molekyler.  

Hvordan brukes restriksjonsenzymer til å lage rekombinant DNA

Rekombinant DNA er et DNA-molekyl bestående av DNA av to eller flere arter. Den inneholder hovedsakelig et gen av interesse fra en donorart og en vektor som bærer genet av interesse for vertscellen. Hovedtrinnene i produksjonen av rekombinante DNA-molekyler er DNA-isolering, fordøyelse med restriktjonsenzymer, ligering av genet av interesse for vektoren og amplifisering av rekombinant DNA-molekyl inne i en vertscelle. Hele prosessen er kjent som molekylær kloning. Molekylær kloning er vist i figur 2.

Figur 2: Molekylær kloning

Genet av interesse isoleres først fra biologiske prøver i form av genomisk DNA, eller det kan amplifiseres ved PCR. Noen ganger kan genet av interesse være tilstede innenfor en vektor. For å bli satt inn i vektoren som er egnet til å bære genet av interesse inn i vertscellen, bør det avskjæres fra modermolekylet. Som restriksjonsenzymer kutter nettopp DNA ved å gjenkjenne restriksjonsseter, kan de brukes til dette formål. Genet av interesse og vektoren kan fordøyes med det samme restriktionsenzym, eller hver ende av genet av interesse kan fordøyes av to restriksjonsenzymer. Denne fordøyelsen gir kompatible ender for ligeringen av genet av interesse for vektoren. Fordøyelsen med to restriksjonsenzymer tillater ligering av fragmenter i den ønskede orientering. Etter ligering blir de resulterende rekombinante DNA-molekylene transformert til bakterier for å produsere et stort antall kopier.

Konklusjon

Begrensningsenzymer er endonukleaser som kutter DNA på bestemte steder som kalles restriksjonsseter. Egenskapene til restriksjonsenzymer kan brukes til å produsere rekombinante DNA-molekyler ved å kutte DNA på presise steder. Rekombinant DNA inneholder generelt et gen av interesse innført i en vektor.

Henvisning:

1. "Definisjon av Restriktionsenzym." MedicineNet, tilgjengelig her.
2. Griffiths, Anthony JF. "Gjør rekombinant DNA." En introduksjon til genetisk analyse. 7. utgave., U.S. National Library of Medicine, 1. januar 1970, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "HindIII Restriksjonssted og klebrig endingsvektor" Ved Helixitta - Egentlig arbeid (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Konstruer" Av Joyxi - Eget arbeid (Public Domain) via Commons Wikimedia