Forskjellen mellom RT PCR og QPCR

Nøkkelforskjell - RT PCR vs QPCR
 

Polymerase Chain Reaction er en teknikk som brukes til å amplifisere en bestemt region av DNA in vitro. På grunn av oppfinnelsen av denne teknikken av Kary Mullis i 1983, kan forskere gjøre tusen til millioner av kopier av spesifikke DNA-fragmenter for forskningsformål. For tiden er det blitt en vanlig og rutinemessig utført teknikk i kliniske og forskningslaboratorier for et bredt spekter av applikasjoner. Det finnes variasjoner av tradisjonell PCR-teknikk som RT PCR, nestet PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT-QPCR, etc. RT PCR og Q PCR er to viktige variasjoner av PCR. Hovedforskjellen mellom RT PCR og Q PCR er det RT PCR brukes til å oppdage genuttrykk gjennom opprettelse avkomplementært DNA (cDNA) transkripsjoner fra RNA samtidig som Q PCR brukes til kvantitativt måling av PCR-produktene i sanntid ved bruk av fluorescerende fargestoffer.

INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er RT PCR
3. Hva er QPCR
4. Side ved side sammenligning - RT PCR vs QPCR
5. Sammendrag

Hva er RT PCR?

Omvendt transkripsjons-polymerasekjedereaksjon (RT PCR) er en variant av PCR som brukes til å detektere RNA-ekspresjon. Det er en svært viktig metode for å oppdage mRNA-ekspresjon i vev. RT PCR brukes når utgangsmaterialet i prøven er RNA. I RT-PCR omdannes mRNA-mRNA først til komplementært DNA. Dette trinnet katalyseres av enzymet revers transkriptase og prosessen er kjent som revers transkripsjon. For det andre brukes tradisjonell PCR for det nylig syntetiserte cDNA for amplifikasjonen.

RT PCR er en svært sensitiv teknikk som krever en relativt liten mengde RNA-prøve. RT PCR brukes ofte i diagnosen og kvantifiseringen av RNA-arter, spesielt RNA-virus som humant immunbristvirus og hepatitt C-virus.

Figur 01: RT PCR-teknikk

Hva er QPCR?

Kvantitativ PCR (QPCR) er en variant av PCR som brukes til kvantitativt måling av PCR-produktene. Det refereres også til som real-time polymerasekjedereaksjon siden det måler forsterkningen av sanntid ved hjelp av sanntids PCR-maskin. Det er en egnet metode for å bestemme mengden av en målsekvens eller et gen som er tilstede i en prøve. Den interessante egenskapen til QPCR er at den kombinerer både forsterkning og sann kvantifisering i et enkelt trinn. Derfor kan behovet for gelelektroforese i deteksjon elimineres ved hjelp av QPCR-teknikk. QPCR bruker fluorescerende fargestoffer til å merke PCR-produkter under PCR-reaksjonene som til slutt fører til direkte kvantifisering. Når PCR-produktene akkumuleres, akkumuleres også fluorescerende signaler, og det vil bli målt av sanntidsmaskinen. QPCR kan kombineres med RT PCR. Det er kjent som RT - QPCR eller QRT - PCR og regnes som en mest kraftig, sensitiv og kvantitativ metode for påvisning av RNA - nivåer i cellene eller vevet.

SYBR Green og Taqman er to metoder som brukes til å oppdage eller se amplifikasjonsprosessen av sanntids-PCR. SYBR Green-metoden utføres ved å bruke et fluorescerende fargestoff som kalles SYBR-grønt og detekterer amplifikasjonen ved å binde fargestoffet for å produsere dobbeltstrenget DNA. Taqman utføres ved bruk av dobbelt merkede prober og detekterer amplifikasjonen ved nedbrytning av sonden ved Taq polymerase og utgivelser av fluoroforen som vist i figur 02. Begge metoder overvåker fremdriften av amplifikasjonsprosessen og rapporterer mengden av produktet realtid.

Realtids-PCR har et bredt spekter av applikasjoner som genuttrykkskvantifisering, mikroRNA og ikke-kodende RNA-analyse, SNP-genotyping, deteksjon av kopi-nummervarianter, påvisning av sjeldne mutasjoner, påvisning av genetisk modifiserte organismer, påvisning av smittsomme midler osv..

Figur 02: Kvantitativ PCR-teknikk

Hva er forskjellen mellom RT PCR og QPCR?

RT PCR vs QPCR
RT PCR er en teknikk som brukes til å oppdage genuttrykk ved amplifisering.	QPCR er en teknikk som forsterker DNA og kvantifiserer PCR-produktene i sanntid.
Engasjement av Reverse Transkriptase Enzym
Enzym revers transkriptase brukes til RT PCR.	Enzym revers transkriptase brukes ikke til QPCR.
Bruk av fluorescensmerkede molekyler
Fluorescensmerkede fargestoffer eller prober brukes ikke for RT PCR.	Fluorescensmerkede farger eller prober brukes til QPCR.
Kvantifisering av PCR-produkt
Med mindre kombinert med QPCR, kvantifiserer ikke RT PCR PCR-produktet.	QPCR måler PCR-produktet kvantitativt.
Utgangsmateriale
Utgangsmateriale er mRNA.	Utgangsmateriale er DNA.
Syntese av cDNA
Komplementært DNA produseres under RT PCR.	Komplementært DNA produseres ikke under QPCR.

Sammendrag - RT PCR vs QPCR

RT PCR og QPCR er to versjoner av tradisjonell PCR. RT PCR-teknikk utføres for mRNA-prøver, og den drives av revers transkripsjon og produksjon av cDNA. QPCR brukes til å kvantifisere PCR-produkter i real-time PCR termiske sykluser ved hjelp av fluorescerende fargestoffer eller merkede prober. I QPCR representeres mengden PCR-produkt av de utstrålede fluorescerende signaler av prøven. RT PCR brukes populært som en amplifikasjonsprosess mens QPCR vanligvis brukes som en kvantifiseringsprosess. Dette er forskjellen mellom RT PCR og QPCR.

referanser:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo og GK Agrawal. "Real-Time PCR: Revolusjonerende Deteksjon og Ekspresjon Analyse av Genene." Current Genomics. Bentham Science Publishers Ltd., juni 2007. Web. 3. april 2017
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh og Jo Vandesompele. "Rettferdig og sensitiv RT-qPCR-basert geneekspresjonsanalyse av FFPE-prøver." Nature News. Nature Publishing Group, 22. februar 2016. Web. 3. april 2017
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon og C. Mathieu. "Bruken av sanntids-omvendt transkriptase-PCR for kvantifisering av cytokingenuttrykk." Journal of Biomolecular Techniques: JBT. Sammenslutningen av biomolekylære ressursfasiliteter, mars 2003. Web. 3. april 2017

Bilde Courtesy:
1. "Taqman" Av bruker: Braindamaged - Egentlig arbeid av den opprinnelige opplasteren (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Omvendt transkripsjons-polymerasekjedereaksjon" Av Jpark623 - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia