Forskjellen mellom nordlig sydlig og vestlig blotting

Nøkkelforskjell - Northern vs Southern vs Western Blotting
 

Deteksjon av spesifikke sekvenser av DNA, RNA og proteiner er avgjørende for ulike typer studier i molekylærbiologi. Gelelektroforese er en teknikk som separerer DNA, RNA og proteiner i henhold til deres størrelser. Fra gelprofilene blir spesiell DNA-sekvens, RNA-sekvens eller protein påvist ved spesielle teknikker som kalles blotting og hybridisering med merkede prober. Det er tre forskjellige typer blotting metoder nemlig sørlige, nordlige og vestlige. Hovedforskjellen mellom nordlig sør og vestlig blotting ligger ved typen av molekylet det oppdager fra en prøve. Southern blotting er en metode som detekterer en bestemt DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Northern blotting er en teknikk som oppdager en spesifikk RNA-sekvens fra en RNA-prøve. Western blotting er en metode som oppdager et spesifikt protein fra en proteinprøve.

INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er Southern Blotting
3. Hva er Northern Blotting
4. Hva er Western Blotting
5. Side ved side-sammenligning - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Sammendrag

Hva er Southern Blotting?

Southern blotting teknikk ble utviklet av E. M. Southern i 1975 for identifisering av en bestemt DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Dette er den første blottingsteknikken introdusert i molekylærbiologi. Det muliggjorde deteksjon av bestemte gener fra DNA, spesifikke fragmenter fra DNA, etc. Det er flere trinn involvert i Southern Blotting-teknikk. De er som følger.

1. DNA isoleres fra prøven og fordøyes med restriksjonsendonukleaser.
2. Digestet prøve skilles fra Agarose gelelektroforese.
3. DNA-fragmenter i gelen denatureres til enkle tråder ved bruk av en alkalisk oppløsning.
4. Enkeltstrenget DNA overføres til en nitrocellulosefiltermembran ved kapillæroverføring.
5. Overført DNA festes permanent på membranen.
6. Fast DNA på membranen hybridiseres med merkede prober.
7. Ubundet DNA vaskes fra membranen ved vasking.
8. Røntgenfilm eksponeres for membranen, og en autoradiograf fremstilles.

Southern blotting brukes for ulike aspekter av molekylærbiologi. Det er nyttig i RFLP kartlegging, rettsmedisinske studier, DNA-metylering i genuttrykk, påvisning av muterte gener i genetiske lidelser, DNA fingeravtrykk, etc..

Figur 01: Southern Blotting Technique

Hva er Northern Blotting?

Northern blotting er en metode designet for å detektere en spesifikk RNA-sekvens eller mRNA-sekvens fra en prøve for å studere genuttrykk. Denne teknikken ble utviklet av Alwine, Kemp og Stark i 1979. Den adskiller seg fra de sure og vestlige blottingsteknikkene på grunn av flere trinn. Denne teknikken utføres imidlertid også via gelelektroforese, blotting og hybridisering med spesifikke merkede prober og deteksjon. Northern blotting teknikk utføres som følger.

1. RNA ekstraheres fra prøven og separeres ved gelelektroforese.
2. RNA overføres fra gelen til en blottemembran og fikseres.
3. Membranen behandles med en merket probe fremstilt fra cDNA eller RNA (proben er komplementær til en bestemt sekvens i prøven).
4. Sonden inkuberes med membranen for å binde med en spesifikk sekvens.
5. Ubundne sonder blir vasket av.
6. Hybridiserte fragmenter påvises av en autoradiograf.

Northern blotting er et viktig verktøy i deteksjon og kvantifisering av hybridisert mRNA, studerer RNA-nedbrytning, evaluering av RNA-halveringstid, påvisning av RNA-spleising, studie av genuttrykk, etc.

Figur 02: Northern Blotting

Hva er Western Blotting?

Western blotting er en metode for å detektere et spesifikt protein fra en proteinblanding ved bruk av merket antistoff. Derfor er western blot også kjent som en immunoblot. Denne teknikken ble introdusert av Towbin et al i 1979 og det er nå rutinemessig utført i laboratoriene for proteinanalyse. Trinnene er som følger.

1. Proteiner ekstraheres fra prøven
2. Proteiner separeres av deres størrelser ved anvendelse av polyakrylamidgelelektroforese
3. Separerte molekyler overføres til en PVDF membran eller nitrocellulose membran ved elektroporasjon
4. Membranen er blokkert for ikke-spesifikk binding med antistoffene
5. Overførte proteiner er bundet med primær antistoff (enzymmerkede antistoffer).
6. Membranen vaskes for å fjerne ikke-spesifikt bundet primære antistoffer
7. Bundet antistoffer detekteres ved å tilsette et substrat og detektere det dannede fargede bunnfall

Western blotting er nyttig ved påvisning av anti-HIV-antistoffer i en human serumprøve. Western blot kan også brukes som en bekreftende test for infeksjon av hepatitt B og endelig test for gal ku sykdom.

Figur 03: Western Blotting

Hva er forskjellen mellom Northern Southern og Western Blotting?

Northern vs Southern vs Western Blotting
Type Molekyl funnet
Northern Blotting	Northern blotting oppdager en spesifikk RNA-sekvens fra en RNA-prøve.
Southern Blotting	Southern blotting oppdager en bestemt DNA-sekvens fra en DNA-prøve.
Western Blotting	Western blotting oppdager et spesifikt protein fra en proteinprøve.
Type gel
Northern Blotting	Dette bruker Agarose / formaldehyd gel.
Southern Blotting	Dette bruker en Agarose gel.
Western Blotting	Dette bruker polyakrylamidgel.
Blotting Method
Northern Blotting	Dette er en kapillær overføring.
Southern Blotting	Dette er en kapillær overføring.
Western Blotting	Dette er en elektrisk overføring.
Probes brukt
Northern Blotting	cDNA- eller RNA-prober merket radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
Southern Blotting	DNA-prober merkes radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
Western Blotting	Primærantistoffer brukes som prober.
Deteksjonssystem
Northern Blotting	Dette gjøres ved hjelp av en autoradiograf, eller deteksjon av lys eller fargeendring.
Southern Blotting	Dette gjøres ved hjelp av en autoradiograf, gjenkjenning av lys eller fargeendring.
Western Blotting	Dette gjøres ved hjelp av deteksjon av lys eller fargeendring.

Sammendrag - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting er en spesiell teknikk utviklet for identifisering av spesifikt DNA, RNA eller protein fra prøvene. Det er tre separate blotting prosedyrer, nemlig nordlige, sørlige og vestlige, for å oppdage en bestemt type molekyl. Northern blotting teknikk er designet for å oppdage en bestemt RNA sekvens fra en blanding av RNA. Southern blotting-teknikk muliggjør deteksjon av en spesifikk DNA-sekvens fra en DNA-prøve, og western blotting-teknikk er utviklet for å identifisere et bestemt protein fra en proteinblanding.

referanser
1. Gibbons, Janay. "Western Blot: Protein Transfer Overview." Nord-American Journal of Medical Sciences. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, mars 2014. Web. 27. mars 2017
2. Brown, T. "Southern blotting." Nåværende protokoller i immunologi. U.S. National Library of Medicine, mai 2001. Web. 27. mars 2017
3. Han, Shan L. "Northern blot." Metoder i enzymologi. U.S. National Library of Medicine, 2013. Web. 27. mars 2017

Bilde Courtesy:
1. "Northern Blot Scheme" Av RNA405 - Eget arbeid (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Western blot 114A" Av Amanthabagdon - Eget arbeid (Public Domain) via Commons Wikimedia