Forskjellen mellom varm og kald trypsinisering

Nøkkelforskjell - Varm vs Kald trypsinering
 

Varm og kald trypsinisering er to metoder som brukes i enzymatisk disaggregering av celler i dyrcellekulturer. De nøkkelforskjell mellom varm og kald trypsinisering, som navnene antyder, avhenger av temperaturen ved hvilken trypsinet er tilsatt for cellulær disaggregasjon. Varm trypsinisering finner sted under høyere temperaturforhold (36,5 - 37 ⁰C) mens kald trypsinisering foregår under lave temperaturforhold.

Under prosessen med primærcellekultivering av dyreceller er det tre hovedmetoder benyttet og har vist seg å lykkes. De tre metodene inkluderer mekanisk disaggregering av celler, enzymatisk disaggregering av celler og primær explantteknikk. Den enzymatiske disaggregasjonen av celler som fører til isolering av celler, og den gjøres ved hjelp av det proteindrevende enzym trypsin. Derfor er denne prosessen kjent som trypsinisering. Trypsinisering kan gjøres under to forskjellige forhold, nemlig varm trypsinisering og kald trypsinisering. Varm trypsinisering er metoden for behandling av cellene med trypsin under varme forhold ved en temperatur på 36,5 - 37 ⁰C. Kold trypsinisering er prosessen med trypsinbehandling som foregår under kaldere betingelser, fortrinnsvis i isen som opprettholder svært lave temperaturer.

INNHOLD

1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er varm trypsinisering
3. Hva er kald trypsinisering
4. Likheter mellom varm og kald trypsinisering
5. Side ved side sammenligning - Varm vs kald trypsinisering i tabellform
6. Sammendrag

Hva er varm trypsinisering?

Trypsinisering kan gjøres for å disaggregere de cellulære komponentene for å isolere cellene for å produsere en primær cellekultur. Trypsin er et protein degraderingsenzym, og enzymmengden som brukes i trypsinisering, kan enten være et ubeskyttet ekstrakt eller et renset produkt. Råekstraktet sies å være mer effektivt i proteinlys og celleoppløsning da det inneholder andre nedbrytende enzymer.

Varm trypsinisering er den mest brukte enzymatiske metoden for celle disaggregasjon som foregår under høyere temperaturforhold. Før behandling ved trypsinisering, blir det ønskede vevet hugget i mindre stykker. Det letter den enkle disaggregasjonsprosessen. Det hakkede vevet vaskes deretter i et spesielt medium kjent som Dissection Basal Salt-medium.

Etter ferdigstillelse av vaskestrinnet blir cellene transformert til en kolbe inneholdende det aktive enzym, som er trypsin. Da denne teknikken innebærer en varm trypsiniseringsprotokoll, blir trypsinet plassert ved en temperatur på rundt 37 ⁰C i ca fire timer.

Figur 01: Trypsin

Innholdet blandes og omrøres ved bruk av sentrifugeringsmetoder for enkel protokoll og for å øke disaggeringsprosessen. Når den anbefalte tiden er oppnådd, kan cellene avledes fra supernatanten. Cellene avledet fra supernatanten inkuberes deretter ved en bestemt temperatur og tid.

Hva er kald trypsinisering?

Kald trypsinisering er den andre typen trypsinisering som foregår under kalde forhold. I denne teknikken blir cellene som er hakket og vasket, plassert i hetteglass på is og så gjennomvåt med trypsin. Soakingperioden er mye lengre - ca 6 - 24 timer.

Etter fullføring av gjennombløtningsprosessen blir trypsinet fjernet fra cellelysatet, og vevstykkene inkuberes videre ved 37 ⁰C i ca 20 - 30 minutter. Disaggregasjonen av cellene oppnås ved gjentatt pipettering av vevsblandingen. Dette vil tillate at cellene dissocierer fra membranen og kommer til supernatanten. Når cellene er i supernatanten, inkuberes de og dyrkes ved en ønsket temperatur og tidsperiode.

Den kalde trypsiniseringsmetoden har flere fordeler

• Høyere utbytt av levedyktige celler da celleskaden minimeres. Cellskade er minimert ved ikke å bruke sentrifugeringstrinn.
• Meget praktisk metode.
• Mindre arbeidskrevende.

Hovedbegrensningen av den kalde trypsiniseringsmetoden er at store mengder ikke kan brukes i ett tilfelle.

Hva er likhetene mellom varm og kald trypsinisering?

• Både varme og kalde trypsiniseringsprosesser bruker enzymet trypsin til disaggregering av celler.
• Både varme og kalde trypsiniseringsprosesser anvendes i cellekulturprosedyrer for disaggregering av celler.
• I både varme og kalde trypsiniseringsbehandlinger, er cellene avledet fra supernatanten.

Hva er forskjellen mellom varm og kald trypsinisering?

Varm vs kald trypsinisering
Varm trypsinisering er metoden for behandling av cellene med trypsin under varme forhold ved en temperatur på 36,5 - 37 0.	Kald trypsinisering er prosessen med trypsinbehandling som foregår under kaldere forhold, fortrinnsvis i isen som opprettholder svært lave temperaturer.
protokoll
De hakket vevstykkene holdes på 37 0C kontinuerlig gjennom hele prosedyren.	De hakkede vevstykkene holdes opprinnelig ved iskalde temperaturer og opprettholdes deretter ved 37 ° C 0.
Temperatur
Varm trypsinisering opptrer ved 36,5 - 37 0	Kald trypsinisering oppstår ved iskalde temperaturer.
Tid forbrukes
Mindre tid kreves for hele prosessen (ca. 4 timer) med varm trypsinisering.	Lengre tid kreves (rundt 6 - 24 timer) for kald trypsinisering.
Utbytte av levedyktige celler
Lav i varm trypsinisering.	Høy i kald trypsinisering.
Bruk av sentrifugering
Sentrifugering kreves for disaggregering av celler i varm trypsinisering.	Sentrifugering kreves ikke ved kald trypsinisering.
Initial væskemengde for trypsinisering
En større mengde vev kan brukes i varm trypsinisering.	En mindre mengde vev kan brukes i kald trypsinisering.
Cellskade
Høy på grunn av sentrifugering ved varm trypsinisering.	Mindre på grunn av kald trypsinisering.

Sammendrag - Varm vs Kald trypsinering

Trypsinisering er metoden for å bruke det proteindraderende enzym trypsin for disaggregasjon og fremstilling av primære cellekulturer under cellekultiveringsprosessen. Det er to hovedteknikker for trypsinisering basert på temperaturene som brukes under prosedyren. De er varm og kald trypsinisering. Varm trypsinisering utføres ved 37 ⁰C mens kald trypsinisering utføres under iskalde forhold. Selv om kald trypsinisering tar lengre tid for ferdigstillelse, sies det å ha et høyere utbytte av levedyktige celler. Dette skyldes det faktum at cellebeskadigelse minimeres ved kald trypsinisering, da den ikke bruker kraftige sentrifugeringstrinn. Dette er forskjellen mellom varm og kald trypsinisering.

Henvisning:

1. "Trypsinisering." Trypsinisering - en oversikt | ScienceDirect-emner. Tilgjengelig her 
2. "Primærcellekultur: 3 teknikker (med diagram)." Biologisk diskusjon, 16. okt. 2015. Tilgjengelig her  

Bilde Courtesy:

1.'Trypsin aktiv site'By Fdardel - Eget arbeid, (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia