Forskjell mellom Sanger Sequencing og Pyrosequencing
Share
Nøkkelforskjell - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNA-sekvensering er svært viktig for DNA-analyse, siden kunnskap om riktig nukleotidarrangement på en bestemt DNA-region avslører mange viktige opplysninger om det. Det finnes forskjellige DNA-sekvenseringsmetoder. Sanger-sekvensering og Pyrosequencing er to forskjellige DNA-sekvenseringsmetoder som er mye brukt i molekylærbiologi. Hovedforskjellen mellom Sanger-sekvensering og Pyrosequencing er det Sanger-sekvensering bruker dideoxynukleotider til å terminere syntesen av DNA for å lese nukleotidsekvensen mens pyrosequensing detekterer pyrofosfatfrigivelsen ved å inkorporere nukleotidene og syntetisere den komplementære sekvensen for å lese nøyaktig rekkefølgen av sekvensen.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er Sanger Sequencing
3. Hva er Pyrosequencing
4. Side ved side-sammenligning - Sanger-sekvensering vs Pyrosequencing
5. Sammendrag
Hva er Sanger Sequencing?
Sanger-sekvensering er en første generasjons DNA-sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger og hans høyskoler i 1977. Det er også kjent som Chain Termination Sequencing eller Dideoxy-sekvensering siden den er basert på kjedeavslutning av dideoxynukleotider (ddNTPer). Denne metoden ble mye brukt i mer enn 30 år til New Generation Sequencing (NGS) ble utviklet. Sanger-sekvenseringsteknikk aktiverte oppdagelsen av den korrekte nukleotidrekkefølge eller vedlegget av et bestemt DNA-fragment. Den er basert på selektiv inkorporering av ddNTP og terminering av DNA-syntese under in vitro DNA-replikasjon. Fraværet av 3'-OH-grupper for å fortsette fosfodiesterbindingsdannelse mellom tilstøtende nukleotider er et unikt trekk ved ddNTP. Derfor, når ddNTP er festet, opphører kjedeforlengelsen og slutter fra det punktet. Det er fire ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP og ddTTP - brukt i Sanger-sekvensering. Disse nukleotidene stopper DNA-replikasjonsprosessen når de innlemmes i den voksende DNA-strengen og resulterer i varierende lengder av kort DNA. Kapillærgelelektroforese brukes til å organisere disse korte DNA-strengene av deres størrelser på en gel som vist i figur 01.
Figur 1: Kapillærgelelektroforese av syntetisert kort DNA
Til in vitro replikering av DNA, bør det ikke gis noen krav. De er DNA-polymeraseenzym, mal-DNA, oligonukleotidprimere og deoksynukleotider (dNTP'er). I Sanger-sekvensering utføres DNA-replikasjon i fire separate reagensrør sammen med fire typer ddNTP'er separat. Deoksynukleotider erstattes ikke helt av de respektive ddNTPene. En blanding av den spesifikke dNTP (for eksempel dATP + ddATP) er inkludert i røret og replisert. Fire separate rørprodukter kjøres på en gel i fire separate brønner. Deretter kan sekvensen bygges som vist i figur 02 ved å lese gelen.
Figur 02: Sanger-sekvensering
Sanger-sekvensering er en viktig teknikk som hjelper i mange områder av molekylærbiologi. Human genomprosjekt ble vellykket gjennomført ved hjelp av Sanger-sekvenseringsbaserte metoder. Sanger-sekvensering er også nyttig i mål-DNA-sekvensering, kreft- og genetisk sykdomsforskning, genekspresjonsanalyse, humanidentifikasjon, patogen-deteksjon, mikrobiell sekvensering osv..
Det er flere ulemper med Sanger-sekvensering:
- Lengden på DNA som sekvenseres, kan ikke være lenger enn 1000 basepar
- Bare en streng kan sekvenseres av gangen.
- Prosessen er tidkrevende og kostbar.
Derfor ble nye avanserte sekvenseringsteknikker utviklet med tiden for å overvinne disse problemene. Imidlertid er Sanger-sekvensering fortsatt i bruk på grunn av sine svært nøyaktige resultater opptil 850 baseparlengdefragmenter.
Hva er Pyrosequencing?
Pyrosequencing er en ny DNA-sekvenseringsteknikk basert på "sekvensering ved syntese". Denne teknikken er avhengig av deteksjon av pyrofosfatfrigivelse ved nukleotidinkorporasjonen. Prosessen er benyttet av fire forskjellige enzymer: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase og apyrase og to substrater adenosin 5 'fosfosulfat (APS) og luciferin.
Prosessen starter med primerbindingen med den enkeltstrengede DNA-malen og DNA-polymerase starter inkorporeringen av nukleotider som er komplementære til den. Når nukleotidene går sammen (nukleinsyrepolymerisering), frigjør det pyrophosphat (to fosfatgrupper bundet sammen) grupper og energi. Hvert nukleotidtilsetning frigjør ekvimolær mengde pyrofosfat. Pyrofosfat omdannes til ATP ved ATP-svovelylase i nærvær av substrat-APS. Den genererte ATP driver den luciferase-medierte omdannelse av luciferin til oksyukiferin, som produserer synlig lys i mengder som er proporsjonale med mengden av ATP. Lys er detektert av en fotonavlesingsenhet eller ved fotomultiplikator og oppretter et pyrogram. Apyrase nedbryter ATP og ikke-innlemmet dNTP i reaksjonsblandingen. dNTP tillegg er gjort en gang om gangen. Siden tilsetningen av nukleotid er kjent i henhold til inkorporering og deteksjon av lys, kan sekvensen av malen bestemmes. Pyrogram brukes for å generere nukleotidsekvensen av prøve-DNA som vist i figur 03.
Pyrosequencing er svært viktig i enkel nukleotidpolymorfisanalyse og sekvensering av korte DNA-strekker. Høy nøyaktighet, fleksibilitet, enkel automatisering og parallellbehandling er fordelene med pyrosequencing over Sanger-sekvenseringsteknikker.
Figur 03: Pyrosequencing
Hva er forskjellen mellom Sanger Sequencing og Pyrosequencing?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing | |
| Sanger-sekvensering er en DNA-sekvenseringsmetode basert på den selektive inkorporering av ddNTPer ved DNA-polymerase og kjedeavslutning. | Pyrosequencing er en DNA-sekvenseringsmetode basert på deteksjon av pyrofosfatfrigivelse ved inkorporering av nukleotid. |
| Bruk av ddNTP | |
| ddNTPs brukes til å terminere DNA-replikasjonen | ddNTPs er ikke brukt. |
| Enzymer involvert | |
| DNA-polymerase anvendes. | Fire enzymer blir brukt: DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase og apyrase. |
| Substrates Used | |
| APS og luciferin brukes ikke. | Adenosin 5 'fosfosulfat (APS) og luciferin brukes. |
| Maksimal temperatur | |
| Dette er en sakte prosess. | Dette er en rask prosess. |
Oppsummering - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-sekvensering og Pyrosequencing er to DNA-sekvenseringsmetoder som brukes i molekylærbiologi. Sanger-sekvensering konstruerer rekkefølgen av nukleotidene i rekkefølge ved å avslutte kjedeforlengelsen mens pyrosequensjonen konstruerer nøyaktig rekkefølgen av nukleotidene i rekkefølge ved inkorporering av nukleotider og påvisning av frigjøring av pyrofosfater. Derfor er hovedforskjellen mellom Sanger-sekvensering og Pyrosequencing at Sanger-sekvensering virker på sekvensering ved kjedeavslutning mens pyrosequencing virker på sekvensering ved syntese.
Henvisning:
1. Fakruddin, Md, og Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-et alternativ til tradisjonell sanger-sekvensering." American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Science Publikasjoner, 02 Mar. 2012. Web. 28. februar 2017.
2. "Sanger-sekvensering." Sanger-sekvensering - ScienceDirect-emner. N.p., n.d. Web. 28. februar 2017
Bilde Courtesy:
1. "Didesoxy-Metode" Av Christoph Goemans (modifiserende) - Dr. Norman Mauder, som er grunnlegger av Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" Av Enzo på det polske språket Wikipedia (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencing" av mikrobiologibytes (CC BY-SA 2.0) via Flickr
