Forskjellen mellom genkloning og PCR
Share
Nøkkelforskjell - Gene Cloning vs PCR
Syntesen av mange kopier av DNA fra et spesifikt DNA-fragment kalles DNA-amplifikasjon. Det er to hoved DNA amplifikasjonsprosesser, nemlig genkloning og PCR. Hovedforskjellen mellom genkloning og PCR er, genkloning produserer flere kopier av et spesifikt gen in vivo ved å konstruere et rekombinant DNA og vokse i en vertsbakterie mens PCR produserer millioner av kopier av et bestemt DNA-fragment in vitro gjennomgår gjentatte sykluser av denaturering og syntese.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er Gene Cloning
3. Hva er PCR
4. Sammenligning ved siden av siden - Gene Cloning vs PCR
5. Sammendrag
Hva er Gene Cloning?
Genkloning er en teknikk som brukes til å lokalisere og multiplisere et spesifikt gen fra det ekstraherte genomiske DNA av en organisme gjennom konstruksjonen av rekombinant DNA. Genomisk DNA inneholder tusenvis av forskjellige gener kodet for proteiner. Når DNA ekstraheres, inneholder det alle mulige gener det kan bære. Gene kloning teknikk har aktivert deteksjon av et spesifikt gen fra det totale DNA. Derfor tjener genkloning som et viktig verktøy i molekylærbiologi.
Å lage et genomisk bibliotek av en organisme er avgjørende for genkloning hvis det ikke er noen anelse om plasseringen av det relevante genet i DNA. Et genomisk bibliotek er laget ved å bruke følgende trinn.
Trinn 1: Ekstraksjon av total DNA fra en organisme som inneholder det ønskede genet.
Steg 2: Restriksjon fordøyelse av det ekstraherte DNA for å produsere små håndterbare fragmenter. Dette trinnet forenkles av restriksjonsendonukleaser.
Trinn 3: Utvelgelse av en egnet vektor og åpning av vektor-DNA ved bruk av de samme restriksjonsendonukleaser. Bakterielle plasmider blir ofte brukt som vektorer for å bære fremmed DNA. Plasmider er små sirkler av DNA som ligger i bakterier.
Trinn 4: Kombinasjon av vektor DNA og fragmentert DNA for å produsere rekombinant DNA molekyl. Dette trinnet styres av DNA ligase.
Trinn 5: Overføring av rekombinante DNA-molekyler til vertsbakterier. Dette trinnet er kjent som transformasjon, og er gjort ved hjelp av et varmeskudd.
Trinn 5: Screening av transformerte bakterielle celler på et kulturmedium. En blandet populasjon av transformerte og ikke-transformerte vertsceller er oppnådd ved slutten av transformasjonsprosessen. Som gen av interesse inkluderer bare i transformerte vertsceller. Derfor er det nødvendig å velge transformerte celler. Utvalget er laget ved hjelp av selektive medier som inneholder antibiotika. Bare de transformerte cellene vokser på dette screeningsmediet som gjør det mulig å velge.
Trinn 6: Vokser av bakterier for å produsere et genbibliotek. I dette trinnet blir de transformerte vertsceller innført i friske dyrkningsmedier som gir optimale vekstkrav. Totale kolonier på kulturplattene representerer det genomiske biblioteket av den organismen.
Trinn 7: Det rekombinante DNA-molekylet som inneholder genet av interesse, må screenes fra tusenvis av klonede fragmenter av rekombinant DNA. Det kan oppnås ved bruk av prober som markerer det spesifikke genet eller det spesifikke proteinet som resultat av det genet.
Når det interesserte genet som inneholder bakteriekolonien er identifisert fra de totale koloniene, er det mulig å lage millioner av kopier av det rekombinante plasmid som inneholder genet.
Gene kloning brukes til å etablere genbiblioteker, produsere spesialprotein, vitaminer, antibiotika, hormoner, sekvensering og kartlegging av genene av organismer, og gjør flere kopier av individer DNA i rettsmedisin mv..
Figur_1: Gene Cloning
Hva er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en teknikk som genererer et stort antall kopier av et bestemt DNA-fragment. Eksponensiell amplifisering av en bestemt DNA-sekvens oppnås ved PCR under in vitro forhold. Denne teknikken er et veldig kraftig verktøy i molekylærbiologi, siden den kan multiplisere en liten prøve av DNA til et brukbart beløp. PCR ble introdusert av Kary Mullis i 1983, og denne prisvinnende oppfinnelsen skapt en stor fremgang i molekylærbiologi.
PCR-teknikken følger gjentatte PCR-reaksjoner som vist i figur 02. En PCR-reaksjon består av tre hovedtrinn som forekommer ved tre forskjellige temperaturer; denaturering av dobbeltstrenget ved DNA ved 94 0C, annealing av primere ved 68 0C og strengforlenging ved 72 0C. Derfor, når PCR utføres, bør temperatursvingninger høyt vedlikeholdes for riktig replikering. PCR utføres i en PCR-maskin inne i PCR-rør. PCR-rør er lastet med korrekte PCR-blandinger inneholdende template DNA, Taq polymerase, primere, dNTPer og buffer. Denaturering av dobbeltstrenget prøve DNA i enkeltstrenget DNA gjøres ved å bryte hydrogenbindingene mellom komplementære baser ved 94 - 98 0C. Da blir enkelte tråder av mal-DNA eksponert for primere. Et par primere (fremover og bakover) skal gis, og de bør være termostabile for å tolerere høye temperaturer. Primers er enkeltstrengede korte DNA-sekvenser komplementære til ender av mål-DNA-fragmentet. Syntetiske primere brukes i PCR. Primerer binder sammen med komplementære baser av prøve-DNA og initierer syntesen av en ny streng. Dette trinnet blir katalysert av et enzym kalt Taq polymerase; et termostabilt DNA-polymeraseenzym isolert fra Thermus auqaticus. Når primere og nukleotider (byggeblokker) er tilgjengelige, konstruerer Taq polymerase den nye DNA-strengen som er komplementær til mal-DNA. På slutten av PCR-programmet observeres amplifisert DNA-fragment ved bruk av gelelektroforese. Hvis ytterligere analyse er nødvendig, blir PCR-produktet renset fra gelen.
PCR er svært nyttig for diagnostisering og overvåking av genetiske og oppkjøpte sykdommer, identifisering av kriminelle (innen rettsmedisin), studere strukturen og funksjonen til et målrettet segment av DNA, sekvensering og kartlegging av organismer, etc. PCR er blitt en rutinemessig laboratorieteknikk i medisinske og molekylærbiologiske forskningslaboratorier blant forskere, siden det har et stort utvalg av applikasjoner.
Figur_2: Polymerase Chain Reaction
Hva er forskjellen mellom genkloning og PCR?
Gene Cloning vs PCR | |
| Gene kloning er prosessen med å lage flere kopier av et bestemt gen in vivo gjennom rekombinant DNA og transformere til en vertsbakterie. | PCR-teknikken produserer flere kopier av en bestemt DNA-sekvens in vitro gjennom gjentatte sykluser av PCR-reaksjoner. |
| Krav på å konstruere rekombinant DNA | |
| Rekombinant DNA produseres for å lokalisere genet. | Rekombinant DNA produseres ikke. |
| Behov for arbeidskraft | |
| Denne prosessen er arbeidsintensiv. | Intensivt arbeid er ikke nødvendig. |
| In vivo eller In vitro prosess | |
| Konstruksjon av rekombinant DNA er in vitro og amplifikasjonen av DNA er in vivo. | Amplifiseringen av DNA skjer helt in vitro. |
Sammendrag - Gene Cloning vs PCR
Gene kloning og PCR er to metoder som brukes til DNA amplifisering. PCR er en in vitro prosess som gjør flere kopier av DNA av et bestemt DNA-fragment uten å bruke rekombinant DNA og en vertsorganisme. Gene kloning er primært en in vivo prosess som resulterer i flere kopier av et interessert gen inne i vertsorganismen via konstruksjon av rekombinant DNA. Dette er forskjellen mellom genkloning og PCR.
Henvisning:
1. Griffiths, Anthony JF. "Kloning av et bestemt gen." Moderne genetisk analyse. U.S. National Library of Medicine, 01 Jan. 1999. Web. 22. februar 2017
2. "Polymerase Chain Reaction (PCR)." National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine, n.d. Web. 22. februar 2017
Bilde Courtesy:
1. "Figur 17 01 06" Av CNX OpenStax - (CC BY 4,0) via Commons Wikimedia
2. "PCR" Av Madprime - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
